miRNA在類風濕關節炎中的研究進展

孫華麟綜述，葉志中，尹志華審校

(深圳市第四人民醫院香蜜湖風濕病分院風濕免疫科廣東醫學院深圳風濕病研究所，廣東深圳518040)

miRNA在類風濕關節炎中的研究進展

孫華麟綜述，葉志中*，尹志華審校

(深圳市第四人民醫院香蜜湖風濕病分院風濕免疫科廣東醫學院深圳風濕病研究所，廣東深圳518040)

類風濕關節炎的發病機制尚不明確，其發病率隨著醫學檢測手段的提升而有所增高，研究類風濕關節炎的發病機制無論對患者還是醫學界都意義重大。本綜述著重研究miRNA在類風濕關節炎中的發病機制。

類風濕關節炎；miRNA；發病機制

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是最常見的結締組織病之一，我國初步調查顯示發病率為0.32%～0.40%，按調查顯示的發病率推斷，我國有RA患者400萬左右。我們曾對深圳地區進行風濕性疾病的流行病學調查，結果顯示RA的患病率為0.44%，而RA的誤診率、早期診斷率和不合理用藥率分別為35%、54%和46%[1]。早期、可靠的診斷對于采取適當的治療控制病情的發展、避免不可逆的關節損傷是十分重要的。miRNA(MicroRNA，微小RNA)是一種長度約為18～25個核苷酸的內源性、非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于多種生物體內，并且具有高度同源性。從1993年首次在線粒體內發現miRNA，到現在已發現15 172種miRNA存在于各種生物體內，存在于人體內的有891種[2]。它可能調控著至少1/3的人類編碼蛋白基因。已經有較多研究驗證miRNA參與了多個系統疾病的發生發展，包括腫瘤、自身免疫性疾病及心功能不全等，且Mitchell等[3]和Gilad等[4]的檢測結果表明血漿中的內源miRNA分子和血清miRNA不僅為各種常見病種和疑難雜癥的研究開闊了思路和方向，并且其本身就具有極好的生物標志物的潛力。本綜述著重介紹miRNA與類風濕關節炎的最新研究進展。

1 miRNA的形成、成熟及其功能

miRNA被認為是從DNA轉錄、不被翻譯但能調控其他基因表達的分子。在動物體內，miRNA的生成和成熟是一個逐漸變短的過程，這個過程主要有賴于兩種被稱作Drosha和Dicer的核酸酶Ⅲ的加工過程。首先，細胞核內，在RNA聚合酶Ⅱ的幫助下，相應基因被轉錄形成一種長鏈初始miRNA(pri-miRNA)，包含成熟miRNA序列和變化多端的側翼序列。然后，pri-miRNA被Drosha和它的合作蛋白DGCR8加工成前體miRNA(pre-miRNA)分子，與pri-miRNA不同的是，它大約有70個核苷酸長度，并帶有莖環結構。隨后，pre-miRNA由特定的核輸出蛋白Exportin5/RanGTP識別，并轉運至胞漿；在胞漿中，在Dicer的作用下，pre-miRNA進一步被加工成約21個核苷酸長度的雙鏈miRNA分子，其結構與siRNA的結構相似[5]。接著，其中一條單鏈選擇性的與miRNA誘導產生的沉默復合體(RISC)相連，目的是為了與RISC中目標mRNA的3'非翻譯區相互補，一旦轉錄后立即水平降解目標mRNA或抑制其進行翻譯[6]；另一條單鏈則被降解。通常一個基因可以被多個miRNA所調節，同時一個miRNA也可以調節多個mRNA。miRNA表達具有高度的保守性、時序性和組織特異性。一方面，miRNA主要通過影響mRNA的穩定性或者抑制目標mRNA的翻譯過程在體內參與多種細胞的增殖、成熟、分化[7]、凋亡[8]和類脂質化合物代謝作用[9]以及器官形成[10]、胚胎發育，從而在生物體內的各種生理過程中起著重要的調控作用；另一方面，還參與人類許多疾病的形成，在腫瘤疾病中，miRNA可以作為抑癌基因，當其表達降低時促進腫瘤發生；可以作為癌基因，當其表達增強時也促進腫瘤的發生，如在侵襲性B細胞白血病中miR-142表達缺失，在Burkitt淋巴瘤中miR-155表達異常增高等；miRNA還與心臟的發育有關，當小鼠失去miR-1-2時，就會改變其心臟的形態，也會影響到其心臟細胞數目的控制，參與研究的小鼠中有半數發生心室穿孔，但目前有關miRNA致病的詳細機制尚未完全明確。

2 miRNA與免疫調節

第一個被發現參與了免疫細胞成熟和分化的miRNA是miRNA-181a。Cuesta等[11]的研究證實通過調節p27mRNA的翻譯miR-181a可以達到調節髓源細胞成熟分化的目的。Chen等[7]研究發現miR-181a在人體的某些與免疫功能相關的器官和細胞中都有所表達，如胸腺、脾臟、骨髓的前體細胞以及B220+細胞，其中在胸腺中表達最高，在后三者中表達明顯偏低；并且，當miR-181a在骨髓干細胞和前體細胞中異常表達時，不僅可以造成B細胞增殖，還使T細胞減少，主要是CD8+T細胞的減少。例如，Liu等[12]的研究證實胸腺前體細胞中高表達的miR-181a可以促進CD4CD8+T細胞的分化。深入研究顯示，一方面，miR-181a通過增強T細胞對抗原的敏感性對T細胞起調節作用；另一方面通過靶向針對Bcl-2、CD69及TCR起作用[7，13-14]。這些均說明miR-181a也參與了對T細胞的調節作用。

miR-155、miR-146是免疫系統中研究較多的兩種miRNA，現逐一介紹。在最初的研究中，人類B細胞淋巴瘤組織有高表達的miR-155[15]，從正面來證實：在miR-155轉基因鼠中，B細胞出現了惡變[16]，這些均提示miR-155可能參與調節了B細胞的增殖和分化；從反面來證實：對于miR-155基因敲除鼠，在B細胞方面，因其原始B細胞數目減少從而導致無法對原始刺激做出正常的免疫應答，雖然其成熟B細胞的數目正常，但仍然出現了免疫缺陷；在T細胞方面，對于抗原的刺激，其體內T細胞分泌IL-2及IFN-γ明顯減弱[16]，檢測T細胞的表達顯示該小鼠Th2細胞因子表達明顯升高，表明其體內的T細胞表型趨向于Th2型[17-18]。另有研究已經證實，miR-155對于CD4+Treg細胞的增殖分化是必須的。由此可見，miR-155不僅對B細胞的增殖分化起了重要的調節作用，對T細胞也是如此。

諸多報道指出，miR-146a表達于RA患者滑膜組織的T細胞中；另外，已有研究證實IL-17是RA患者病理損傷的一個重要因子，其在RA患者的滑膜組織中發現，但在OA患者的滑膜組織中并未發現。在Takuya等[19]的研究中，RA患者11名，OA患者10名。患者RA1、RA4的病情屬于高活動期，他們的IL-17、miR-146a的表達水平與其他患者相比是比較高的，且他們的IL-17、miR-146a表達水平是相似的。在早期RA患者和高活動期RA患者的外周血單核細胞(PBMC)和滑液組織中，miR-146a和IL-17的表達密切相關。對擴展產生IL-17的T細胞微陣列芯片分析提示包括miR-146a在內的六種miRNA很明顯地上調了產生IL-17的T細胞分化過程，用實時定量PCR方法也證實了這一點。本實驗的雙著色步驟顯示miR-146+的細胞與IL-17融合了，因此提示產生IL-17的T細胞可以表達miR-146a，而產生IL-17的細胞來自于CD4+T細胞，他們還發現miR-146最初在CD68+的巨噬細胞中表達，后來也在RA患者滑膜組織的CD3+T細胞和CD79a+B細胞中表達，(miR-146a可以調節產生IL-17的T細胞，而在上述T、B細胞中又證實有miR-146a的表達)，這些均可以證明miR-146a可能間接地調節了T細胞和B細胞在RA中的表達。

3 miRNA與類風濕關節炎

類風濕關節炎(RA)是以侵犯全身關節滑膜為主的慢性自身免疫性疾病，其主要特征為滑膜細胞過度增殖、滑膜細胞激活以及大量血管翳形成，造成骨、軟骨侵蝕性破壞，最終導致關節畸形和功能喪失。已有相關研究證實，炎癥性細胞因子包括IL-1、IL-17[19]、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與RA的起病和發展有著密切的關系。抑制上述因子可阻止疾病的進一步發展，抑制關節的進一步損傷，從而達到改善RA患者病情的作用。

2008年Stanczyk等[20]首先利用實時定量PCR方法檢測RA患者滑膜組織miR-155和miR-146a是表達上調的，還發現TNF-α、IL-1β等可誘導miR-155的產生，過表達的miR-155可以抑制MMP-3的產生。Kaleb等[6]的實驗顯示，在PBMC中RA患者miR-146a、miR-155、miR-132、miR-16的含量分別是健康對照組的2.6、1.8、2.0、1.9倍，但miRlet-7a的表達在RA與健康對照組間差異無統計學意義[21]。進一步研究miRNA的表達與RA活動性的關系發現，miR-146和miR-16的高表達與RA的活動性有關，在RA的緩解期miR-146和miR-16低表達，這提示miR-146和miR-16可以作為RA活動性的檢測指標。日本學者Nakasa等[22]也用實時定量PCR和原位雜交方法證實了miR-146在RA患者關節滑膜組織中的表達，體外實驗發現滑膜纖維細胞在加入TNF-α和IL-1β培養后miR-146明顯升高，這說明miR-146a可能與RA中由TNF-α和IL-1β激活的炎癥反應過程密切相關。

Nagata等[23]研究顯示，與對照組相比，RA模型鼠中的miR-15a的表達水平明顯降低，但其靶蛋白Bcl-2蛋白的表達則明顯升高，于是將去端肽膠原作為載體，將雙鏈miR-15a注入實驗組即RA模型鼠的關節腔內。首先通過熒光檢測證實miR-15a在其關節腔的存在，并能被滑膜細胞所攝取以及產生效應；隨后檢測滑膜細胞凋亡的程度，注入3 d后利用caspase3檢測發現，模型鼠近關節腔處滑膜細胞上caspase3的表達增多，而對照組無明顯變化，表明注入的miR-15a可以通過誘發滑膜細胞凋亡來治療RA，這為以miRNA為靶治療RA提供了一定的參考價值。Nakamachi等[24]利用實時定量PCR檢測了156個miRNA在RA患者和骨關節炎(OA)患者滑膜中的表達情況，發現miR-124a在RA中低表達，將miR-124a前體轉染到體外培養的RA滑膜細胞中，可以明顯抑制細胞的增殖并導致細胞在G1期生長阻滯，提示miR-124a在RA翻譯后調控機制中起著重要的作用。

Koichi等[25]的近期研究顯示，RA和OA患者其滑液中miR-16、miR-132、miR-146a、miR-223的含量明顯低于其血漿含量，且他們的滑液含量與血漿含量并沒有明顯相關性；RA患者其滑液miR-16、miR-146a、miR-155和miR-223的含量明顯高于OA患者。實驗還顯示血漿miRNA或是滑液miRNA與血漿miRNA相比，包括miR-16和miR-146a，均明顯與損失的關節數目和DAS28的評分密切相關。因此得出結論，滑液和血漿miRNA可以作為診斷RA和OA的一種潛在的生物標記，同時也可以作為分析他們的病理損傷的一種工具。

4 展望

綜上所述，miRNA與自身免疫性疾病存在著密切的聯系，它一方面參與了免疫細胞的增殖分化過程和免疫應答的調節作用，另一方面參與了某些特定的組織損傷過程。雖然對于miRNA與免疫系統之間的作用有了一些初步的認識，但其具體作用機制尚有待進一步深究。隨著逐步揭示出這些作用機制，及早找出有早期診斷和治療價值的分子靶標，不僅為RA等免疫系統疾病的防治提供新策略，而且具有顯著的社會和經濟意義。

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R593.22

A

1003—6350(2012)08—126—03

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2011-12-19)

國家自然科學基金（編號：81102266）；廣東省科技計劃項目(編號：2010B031600027)；深圳醫學重點建設項目(編號：2005C10)；深圳市科技局資助項目(編號：201002142)

孫華麟(1980—)，女，湖北省宜昌市人，住院醫師，在讀碩士。

*通訊作者：葉志中。E-mail:yezhizhong@126.com