三葉因子3研究進展

周 帥，符國珍

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院暨海口市人民醫院肝膽外科，海南 海口 570208)

三葉因子(Frefoil factor family，TFF)是一類含一個或兩個結構域的分泌蛋白，該結構域是由六個半胱氨酸的三對二硫鍵形成典型的三葉狀結構，因此稱為三葉因子。而此特殊三葉狀結構賦予了TFF家族蛋白耐酸、耐堿和耐蛋白酶水解的特性，同時也是其在胃腸道行使功能所必需的結構。目前研究表明，人類TFF包括三類：乳腺癌相關的多肽(Spasmolytic peptide-2，PS2或Trefoil factor family-l，TFF1)、解痙多肽(Spasmolytic peptide，SP或trefoil factor family-2，TFF2)和小腸三葉因子(Intestinal trefoil factor，ITF或Trefoil factor family-3，TFF3)。 其 中 TFF3 于 1991 年 由Suemori首次在大鼠空腸發現[1]。TFF3在黏膜防御、修復、再生以及免疫系統和神經系統中發揮著重要作用，并且其表達的異常與疾病的發生發展密切相關。

1 分子結構和組織分布

自Suemori等[1]于1991年發現TFF3在小鼠空腸表達以來，Chinery等[2]和Schmitt等[3]在1996年相繼報道了編碼TFF3的基因和其他的三葉因子家族一樣位于染色體21q22.3。TFF3和TFF1一樣都只含有一個環狀構成三葉狀結構域，但在研究TFF3三級結構中發現，其表面(第2、3個環之間)存在一個疏水的口袋狀的結構[4]，而此結構可能就是其與其他蛋白作用的結合位點。TFF3蛋白的等電點是4.75[5]。在體內，TFF3以單聚體或者同源二聚體的形式與其他蛋白質構成化合物而發揮作用。進一步研究發現，TFF3二聚體的三葉狀結構域的N端有一個螺旋狀結構突出于核心基團之外，并且其結構并不像TFF1二聚體是由兩個疏松的單聚體構成，而是由單聚體中的兩個二硫鍵相鏈接，構成緊密的結構[5]。但是有關TFF3二聚體生物與單聚體的活性，目前相關研究存在不同的結果[5-6]。

TFF3在生理狀態下，主要表達于消化道黏膜及其他黏膜中的杯狀細胞。Xian等[7]研究發現，TFF3的表達水平隨著小腸杯狀細胞數量的增多而上升。Kouznetsova等[8]利用 rt-PCR、Western blot等對胃不同部位的黏膜表達TFF3經行了分析，發現胃體的泌酸腺體黏膜表達很少的TFF3，但在胃體、胃竇移行區有大量TFF3的表達，在幽門區以及十二指腸近段有TFF3分泌。Madsen等[9]對體內多種組織TFFS的表達情況研究發現，TFF主要分布于胃腸道，在生理情況下，TFF1主要分布于胃和結腸，TFF2主要分布在胃。TFF3主要分布在結腸，但在很多組織的黏膜表面都可檢測到。

2 生理功能及其作用機制

胃腸道黏膜屏障是維護人體健康的重要因素。腸黏膜屏障損傷的機制包括腸黏膜缺血、缺氧及氧自由基的損傷、細胞因子的損傷、腸道免疫功能受損和細胞凋亡。TFF3在胃腸黏膜機械屏障、生物屏障、化學屏障和免疫屏障等扮演著不同的角色。

2.1 黏膜修復和保護作用 腸黏膜屏障中的杯狀細胞分泌蛋白是腸黏膜的重要組成部分，也是腸道抵御疾病的重要物理屏障。Chen等[10]利用Western blot和免疫沉淀法分析了TFF3、IgGFcγBP和Muc2在腸黏膜疏松層和致密層黏液存在方式，發現這三種腸黏膜分泌的蛋白在腸黏膜中相互鏈接，在黏膜中構成網絡狀結構，從而保護腸黏膜免受胃酸等有害因素的損害。

2.2 抑制黏膜細胞的凋亡 胃腸道黏膜上皮細胞是抵御有害因素的重要屏障，在免疫、炎癥、腫瘤的形成等病理生理過程中NF-κB起著抑制細胞凋亡的作用，從而保護胃腸道黏膜免受外界有害因素的損害。Chen等[10]利用大鼠ICE-18細胞作為研究模型，利用NF-κB阻斷劑研究TFF3對小腸上皮細胞的效應，研究結果表明：①TFF是胃腸道分泌的內源性多肽；②在小腸上皮細胞中，TFF3能促進NF-κB的活性，從而增強ICE-18細胞的抗凋亡能力；③TFF3對小腸上皮細胞的抗凋亡效應是通過NF-κB相關的細胞信號瀑布效應來調節的。但是Loncar等[11]研究缺發現NF-κB和TNF均會導致小腸黏膜TFF3表達的降低，但這種效應能被IκB(NF-κB抑制劑)所抑制。另有研究表明NF-κB轉錄因子亞單位的結合位點在TFF3的5’端區域[12]。但是具體的調節方式以及調控的相關機制有待進一步研究。而PI3-K/Akt途徑促進了TFF3和MUC2在小腸上皮細胞的表達，TFF3又能反過激活PI3-K/Akt途徑，以此來下調Caspase-3/9的活性，因此TFF3在小腸黏膜的杯狀細胞分化中亦扮演著重要的角色[13]。TFF3在抑制腸道黏膜凋亡、杯狀細胞的分化中扮演著不同的角色，從而對黏膜起到保護作用[10]。

2.3 免疫屏障 免疫屏障在胃腸道黏膜保護中也扮演著重要作用。Cook等[14]通過研究發現，TFF3通過促進單核細胞的遷移調節免疫反應，以此發揮對黏膜的修復和保護作用。Tan等[15]發現TFF3通過上調COX-2從而促進上皮細胞分泌PGE-2和PGI-2，從而避免氧化應激對上皮細胞的損傷。從而分析認為TFF3對上皮細胞具有保護和修復作用。

2.4 腫瘤的擴散 除了研究其胃腸道黏膜保護作用，對于TFF3在腫瘤細胞擴散和入侵方面也有一些研究。上皮細胞的形態和運動方面的改變與其細胞間粘附的調節機制的關系比較密切，即E-cadherin/catenin細胞粘附復合物。研究發現轉染TFF3的細胞表達E-cadherin、alpha和beta-catenin都明顯減少，而且E-cadherin表達的減少與轉錄時的甲基化沒有關系。進一步研究發現，轉染hTFF3的細胞E-cadherin半衰期縮短，也就是E-cadherin加速了降解。因此TFF3在轉錄水平以及轉錄后修飾過程中對E-cadherin介導的細胞之間的粘附調節在TFF3的致病以及腫瘤擴散有重要的作用[16]。另一研究也證實了上述說法，TFF3對于黏膜的修復作用是通過下調E-cadherin、加強細胞間連接、促進細胞遷徙來實現的；此外，TFF3亦可上調上皮細胞中tightening cIaudin-l的含量、下調tighteningclcIaudin-2的表達，增強表層細胞的抵抗力、降低上皮的滲透性來達到黏膜修復的目的[17]。

3 TFF3與疾病

3.1 TFF3與炎性疾病 目前，研究發現胃腸道炎性疾病,以及肝臟疾病、胰腺炎等的病變組織中,TFF出現異常表達現象。這種異常一般表現為異位表達和/或表達量增加，其作用與黏膜修復和再生有關。非甾體抗炎藥物所致的胃黏膜損傷會引起黏膜局部的微環境改變，比如上皮細胞的氧供給減少。Hernandez等[18]通過阿司匹林制造大鼠胃黏膜炎癥模型，繼而采用缺氧探針免疫染色、免疫組化、Western blot以及RT-PCR等方法檢測大鼠胃黏膜中TFF3的含量，發現給予阿司匹林的大鼠胃黏膜中TFF3水平是正常組的1.8倍，同時缺氧的胃黏膜TFF3 mRNA的含量是正常組的9.3倍。

3.2 TFF3與腫瘤 目前對TFF3的研究更多的集中在研究其與腫瘤的發生發展相關性。Okada等[19]對小鼠肝癌模型和人的肝細胞癌組織中TFF3的表達情況研究，發現7只小鼠肝癌組織中有6只TFF3基因是高表達的，而在人肝癌組織中有40%的組織中TFF3在mRNA和蛋白水平都升高。進一步深入研究發現TFF3啟動子CpG-260的甲基化水平與TFF3的高表達相關，因此推測TFF3的表達是肝癌發生發展的一個重要過程，同時啟動子的甲基化可能對TFF3的表達具有調控作用，從而抑制肝癌的發展。TFF3的異常表達在甲狀腺[20]、乳腺、胃、腸道22以及免疫系統[14]、中樞系統等[22]腫瘤組織和血中均有報道。但TFF3與腫瘤的具體相互作用目前報道還比較少，有待進一步研究。

4 TFF3檢測與臨床實驗診斷

TFF3是最近十年研究較為熱門的微量分泌蛋白，ELISA以及腫瘤分泌蛋白組學等都是TFF3臨床實驗診斷常用的成熟技術。Vestergaard等[23]設計研發了TFF3的ELISA檢測方法，并進行了初步的應用嘗試。在正常人群血清中TFF3的濃度為91～250 pmol/L，并且其與年齡和性別無關，初步的應用到胃腸道的相關疾病中，研究結果提示血清TFF3水平與臨床病理改變之間具有相關性并且對研究胃腸道相關疾病具有長遠的價值。Xue等[24]應用蛋白組學方法，通過對來自于同一病例的結腸直腸癌原發癌細胞株SW480和淋巴結轉移癌細胞株SW620的比較分析，篩選出TFF3、GDP15等6個潛在的腫瘤標志物。進一步利用Western blot和大規模的血清樣本隊列分析，檢測結果顯示病例組的血清TFF3水平顯著高于正常對照組，淋巴轉移癌高于非淋巴轉移癌。而病例資料分析表明TFF3的高水平與腫瘤的較高組織學分級及TNM分期、轉移的進展程度顯著相關,而與性別、年齡、腫瘤部位無顯著相關性。其研究認為血清TFF3和GDP15檢測可能成為結腸直腸癌鑒別，特別是癌轉移監測的有較高應用價值的臨床診斷試驗。

總之，TFF3是重要的生物學功能調節因子，它的生理病理功能與組織再生修復、細胞遷移、增殖分化乃至腫瘤的發生發展等功能密切相關，這也使其可能作為炎癥發生的調節因子、抑癌基因或癌基因來參與腫瘤的發生和發展。不容置疑的是，大量研究成果所揭示出的其在病理研究中的表現與病理改變之間的相關性，引起了學者們對于TFF3是否可以成為一個新的生物學標志物的研究興趣。對于TFF3是否能應用于臨床診斷,還需要更多的、多中心的、特別是前瞻性的研究資料來加以判斷，這也是學者們共同強調的觀點。可以相信，隨著對TFF3生物學功能研究的不斷深入，特別是在腫瘤復發、腫瘤轉移的監測及療效觀測等方面的研究，TFF3在相關疾病的臨床診斷的潛在價值將會得到進一步的挖掘和展現。

[1]Suemori S,Lynch-Devaney K,Podolsky DK.Identification and characterization of rat intestinal trefoil factor:tissue-and cell-specific member of the trefoil protein family[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88:11017-11021.

[2]Chinery R,Williamson J,Poulsom R.The gene encoding human intestinal trefoil factor(TFF3)is located on chromosome 21q22.3 clustered with other members of the trefoil peptide family[J].Genomics,1996,32:281-284.

[3]Schmitt H,Wundrack I,Beck S,et al.A third P-domain peptide gene(TFF3),human intestinal trefoil factor,maps to 21q22.3[J].Cytogenetics and Cell Genetics,1996,72:299-302.

[4]Diamond M,Bao X,Weinstein H,et al.Identification of putative functional domains of human trefoil factor family-3(TFF3)[J].Gastroenterology,2008,134:747-747.

[5]May FE,Church ST,Major S,et al.The closely related estrogen-regulated trefoil proteins TFF1 and TFF3 have markedly different hydrodynamic properties,overall charge,and distribution of surface charge[J].Biochemistry,2003,42:8250-8259.

[6]Carrasco R,Pera M,May FE,et al.Trefoil factor family peptide 3 prevents the development and promotes healing of ischemia-reperfusion injury in weanling rats[J].J Pediatr Surg,2004,39:1693-1700.

[7]Xian CJ,Howarth GS,Mardell CE,et al.Temporal changes in TFF3 expression and jejunal morphology during methotrexate-induced damage and repair[J].American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology,1999,277:785-795.

[8]Kouznetsova I,Peitz U,Vieth M,et al.A gradient of TFF3(trefoil factor family 3)peptide synthesis within the normal human gastric mucosa[J].Cell and Tissue Research,2004,316:155-165.

[9]Madsen J,Nielsen O,Tornoe I,et al.Tissue localization of human trefoil factors 1,2,and 3[J].J Histochem Cytochem,2007,55:505-513.

[10]Chen YH,Lu Y,De Plaen IG,et al.Transcription factor NF-kappaB signals antianoikic function of trefoil factor 3 on intestinal epithelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,274:576-582.

[11]Loncar MB,Al-azzeh E,Sommer PSM,et al.Tumour necrosis factor alpha and nuclear factor kappa B inhibit transcription of human TFF3 encoding a gastrointestinal healing peptide[J].Gut,2003,52:1297-1303.

[12]Baus-Loncar M,Al-Azzeh E,Romanska H,et al.Transcriptional control of TFF3(intestinal trefoil factor)via promoter binding sites for the nuclear factor kappa B and C/EBP beta[J].Peptides,2004,25:849-854.

[13]Durual S,Blanchard C,Perrot V,et al.Expression of human TFF3 in relation to growth of HT-29 cell subpopulations:involvement of PI3-K but not STAT6[J].Differentiation,2005,73:36-44.

[14]Cook GA,Familari M,Thim L,et al.The trefoil peptides TFF2 and TFF3 are expressed in rat lymphoid tissues and participate in the immune response[J].Febs Letters,1999,456:155-159.

[15]Tan XD,Chen YH,Liu QP,et al.Prostanoids mediate the protective effect of trefoil factor 3 in oxidant-induced intestinal epithelial cell injury:role of cyclooxygenase-2[J].J Cell Sci,2000,113(Pt 12):2149-2155.

[16]zum Buschenfelde DM,Hoschutzky H,Tauber R,et al.Molecular mechanisms involved in TFF3 peptide-mediated modulation of the E-cadherin/catenin cell adhesion complex[J].Peptides,2004,25:873-883.

[17]zum Bueschenfelde DM,Tauber R,Huber O.TFF3-peptide increases transepithelial resistance in epithelial cells by modulating claudin-1 and-2 expression[J].Peptides,2006,27:3383-3390.

[18]Hernandez C,Santamatilde E,McCreath KJ,et al.Induction of trefoil factor(TFF)1,TFF2 and TFF3 by hypoxia is mediated by hypoxia inducible factor-1:implications for gastric mucosal healing[J].British Journal of Pharmacology,2009,156:262-272.

[19]Okada H,Kimura MT,Tan DF,et al.Frequent trefoil factor 3(TFF3)overexpression and promoter hypomethylation in mouse and human hepatocellular carcinomas[J].International Journal of Oncology,2005,26:369-377.

[20]Patel MR,Stadler ME,Deal AM,et al.STT3A,C1orf24,TFF3:putative markers for characterization of follicular thyroid neoplasms from fine-needle aspirates[J].Laryngoscope,2011,121:983-989.

[21]Balcer-Kubiczek EK,Harrison GH,Xu JF,et al.Coordinate late expression of trefoil peptide genes(pS2/TFF1 and ITF/TFF3)in human breast,colon,and gastric tumor cells exposed to X-rays[J].Molecular Cancer Therapeutics,2002,1:405-415.

[22]Derbyshire A,Ludwig M.TFF3 induced Fos protein expression in the magnocellular oxytocin neurons of the hypothalamus[J].Peptides,2004,25:833-838.

[23]Vestergaard EM,Poulsen SS,Gronbaek H,et al.Development and evaluation of an ELISA for human trefoil factor 3[J].Clin Chem,2002,48:1689-1695.

[24]Xue H,Lu B,Zhang J,et al.Identification of serum biomarkers for colorectal cancer metastasis using a differential secretome approach[J].J Proteome Res,2010,9:545-555.