熊思華，劉紅梅，孫海晨

創傷性顱腦損傷(TBI)是導致青壯年患者死亡和殘疾的主要病因之一。近期一項包含2 664例重型顱腦損傷(GCS＜9分)患者的國際回顧性研究中［1］，TBI死亡率高達28%。許多患者雖然存活下來，卻留有神經功能障礙。傷后6個月，只有52%的患者生活可基本自理。也就是說，48%的患者死亡或嚴重殘疾。這些結論被隨后的前瞻性研究證實，包含363例重型顱腦損傷患者的澳大利亞多中心研究(ATBIS)［2］發現，1年死亡率高達35.1%，預后良好率為48.5%。另一晶膠體復蘇隨機對照研究(SAFE)［3］中，重型顱腦損傷2年死亡率和預后良好率分別是32%和46%。嚴重顱腦損傷的高死亡率、高致殘率給個人、家庭乃至整個社會帶來了巨大的精神和物質負擔，除完善相關法律、法規，預防創傷意外的發生，改善顱腦損傷預后的研究也一直是醫學界的重點和熱點。然而，既往臨床研究中，除了手術清除大血腫外，尚未發現能真正改善腦損傷預后的治療方法。但是近年來越來越多的研究表明，促紅細胞生成素(Epo)有望成為改善TBI預后的有效藥物，Epo是通過與促紅細胞生成素受體(EpoR)結合發揮腦保護作用的。本文將綜述Epo/EpoR系統在顱腦損傷中的研究進展。

1 Epo/EpoR系統的結構基礎及信號傳導

1.1 Epo Epo是一種由166個氨基酸殘基組成的糖蛋白，分子量34kDa，屬于I型細胞因子超家族。Epo產生與分泌的過程中，在多肽鏈的氨基端切掉由27個氨基酸殘基組成的疏水性分泌引導肽，成為由166個氨基酸殘基組成的肽鏈［4］。在成熟Epo羧基端166位的精氨酸被切除掉，這樣，循環中的Epo是由165個氨基酸殘基組成［4］。糖類約占Epo總分子質量的40%，總共有4條糖鏈，糖鏈對于Epo的生物活性是必須的，其可以穩定Epo的結構，避免氧自由基對Epo結構的破壞［4］。天然存在的Epo分為α型和β型，兩者只是碳水化合物含量不同，其生物學特性及臨床效果基本相同。

1.2 EpoR EpoR是一種由508個氨基酸組成的跨膜蛋白質，人與鼠有82%的同源性［5］。其結構可分為3部分:胞膜外部分、跨膜區、胞內區部分［5］。胞膜外部分有226個氨基酸，氨基端連接由24個氨基酸組成的信號肽;跨膜區由22個疏水氨基酸構成;胞內區缺少酪氨酸激酶的特征排列順序，故不具備酪氨酸激酶活性;靠近跨膜區的胞內區含基因轉錄調控相關蛋白結構域(Box1)和Box2兩個高度保守的結構域單元，Box1是EpoR與酪氨酸激酶相聯系的部位，蛋白酪氨酸激酶-2(JAK2)是一種非受體型酪氨酸激酶，它通過Box1與EpoR結合，激活后可發揮其激酶活性［5］。JAK2的活性對介導Epo發揮生物效應是至關重要的，若去除EpoR，Box1不能激活JAK2，也就不能引起相關生物效應［5］。EpoR胞內區含8個酪氨酸殘基，Epo刺激使其發生磷酸化，這些磷酸化位點是EpoR與效應蛋白的結合部位［5］。EpoR與Epo結合并誘導細胞內泛素化后將被蛋白酶和溶酶體降解，很少有EpoR能在細胞膜上循環利用［6］。

1.3 Epo/EpoR信號傳導路徑 Epo與EpoR結合后可促進EpoR交聯形成二聚體，導致EpoR相關的酪氨酸激酶JAK2自身磷酸化，使其下游的多個信號途徑磷酸化。近期研究表明，主要信號途徑有胞內開關蛋白(Ras)細胞分裂素活化蛋白激酶(Ras/MAPK)、磷脂酰肌醇激酶-3(PI3-k)、信號轉錄與轉導活化因子5(STAT5)和核因子-κB(NF-κB)，從而導致了一系列抗凋亡機制的啟動［7］。

2 Epo/EpoR的表達與調節

既往研究認為，正常人體內Epo水平很低，組織低氧是促使腎臟生成Epo的誘因。確切的說，Epo基因表達的增加是由低氧誘導轉錄因子(HIF)誘導的，新合成的Epo刺激紅系細胞生成，從而提高血供氧量。傳統觀點認為，Epo僅僅作用于紅系細胞，Epo通過EpoR刺激紅系祖細胞的增殖和分化。近20年的研究發現，除腎臟外，腦、肝和子宮等臟器也可產生Epo。Epo還可因損傷、代謝應激等誘因合成增加，對大腦、脊髓、心臟有保護作用［8］。

除紅系細胞，內皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞和神經細胞中也發現了EpoR［9］。機體損傷時調節EpoR表達的機制尚未明確，EpoR的表達似乎不僅僅由HIF調節，白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子和Epo都可調節EpoR的表達［10］。Chen等［11］發現，組織低氧時誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抑制劑可阻止EpoR的表達的上調。低氧時，誘導型一氧化氮合酶可致NO合成顯著增加，誘導型一氧化氮合酶抑制劑可使NO合成減少，由此可知，EpoR還受NO的調節。

Epo/EpoR在正常成人腦組織內呈低表達狀態。當受到各種類型的腦損傷時，Epo/EpoR表達顯著增加，但Epo升高遲于EpoR，造成Epo相對不足，外源性應用Epo可促進TBI后的神經功能恢復［12］。研究發現，Epo主要由星形膠質細胞產生，少突膠質細胞、神經元也能產生Epo，與鄰近神經元、星型膠質細胞、內皮細胞、小膠質細胞上的EpoR結合，發揮神經保護作用［13］。既往認為，血-腦脊液屏障阻止了腎臟來源的循環Epo的通過，Epo可通過旁分泌和自分泌的方式作用于神經元，不依賴于內分泌Epo系統，外源性應用Epo治療顱腦損傷是無效的。但是隨后的研究表明，Epo不僅可以通過顱腦損傷后被破壞的血-腦脊液屏障，還能通過完整的無損傷的血-腦脊液屏障［14］。Liao等［15］發現EpoR水平在TBI后7d仍呈明顯升高，而內源性Epo則短暫升高，之后便降至正常水平。通過實驗處理使內源性EpoR溶解可加重腦損傷程度，因Epo無法與足夠的EpoR結合，說明內源性Epo通過固定的信號傳導模式參與神經修復，Epo和EpoR缺一不可。在對EpoR表達缺失的轉基因大鼠的創傷研究中，腦組織的神經細胞凋亡數增加，神經細胞分化減少，神經細胞對低氧、谷氨酸興奮性毒性比正常細胞更敏感［16］。Epo治療EpoR缺失的轉基因大鼠時，Epo的神經保護作用未被發現，這說明EpoR對于腦保護是不可或缺的。此外，研究者們［17］還發現，對于腦組織EpoR缺失而造血系統EpoR高表達的轉基因大鼠，Epo仍保留了部分的神經保護作用，如減少大腦皮質和海馬組織損傷，該實驗提示Epo部分神經保護作用很有可能是通過血管EpoR介導的。

3 Epo/EpoR系統的腦保護作用與機制

大量的實驗和臨床研究表明，繼發性腦損傷是TBI致死和致殘的主要原因，表現為腦水腫、腦血流紊亂、血-腦脊液屏障通透性改變、神經細胞死亡［18］。急性腦損傷后，生化傳導路徑的激活使炎癥反應、氧化應激、血管通透性和細胞興奮性毒性升高，導致腦細胞死亡加劇，低氧面積增加甚至全腦損傷［18］。Epo可減少腦挫傷面積、細胞損傷、腦水腫程度，甚至還能恢復認知功能，改善空間記憶［19］。Epo的保護效應機制主要有:

3.1 抗凋亡作用 促凋亡基因Bal2相關的促凋亡基因(Bax)和DP5表達下調，STAT-5和B細胞淋巴瘤/白血病2基因表達上調可減少凋亡細胞。有趣的是，Epo介導的抗凋亡路徑需與蛋白激酶Akt-1緊密結合。例如Epo通過抑制轉錄因子3a的核易位來阻止凋亡基因的翻譯，Epo還可促進NF-κB向細胞核內轉移來激活抗凋亡基因［20］。

3.2 抗細胞興奮性毒性 腦創傷時，谷氨酸受體的過度激活將致神經細胞死亡。一些實驗已經證明，興奮性毒性應激時，預防性給予Epo可提高神經細胞體外培養的存活率，因Epo誘導鈣離子依賴的谷氨酸鹽的釋放減少，增強了神經細胞抵抗谷氨酸鹽毒性的能力［21］。Epo還能促進IL-10的表達，從而抑制促凋亡細胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的活性，最終阻斷谷氨酸誘導的小腦顆粒細胞死亡。

3.3 抗氧化應激 在體外神經細胞培養試驗中，Epo減少了氧化應激后的細胞死亡數。在體內試驗中，Epo可以降低新生小鼠腦缺血、低氧后脂質過氧化的水平，增加抗氧化酶活性，說明Epo有直接的抗氧化作用。Sims等［22］應用相似的試驗方法發現，Epo可增加由神經干細胞分化而來的不同功能的神經細胞內半胱氨酸-谷氨酸鹽轉化能力，從而增強細胞內氧化還原體系的防御能力。Epo還可通過抑制iNOs的活性來減輕腦缺血損傷，NO是一種強作用的氧自由基，是機體內主要的過氧化物之一，這也說明Epo具有間接的抗氧化效能。

3.4 保護血-腦脊液屏障，減輕腦水腫，為腦損傷部位儲存氧供 TBI時內皮細胞功能障礙將破壞血-腦脊液屏障，導致腦水腫和炎癥反應。以牛的血-腦脊液屏障為研究對象，Wang等［23］發現Epo可阻止內皮生長因子介導的血-腦脊液屏障通透性改變。隨后其他研究者還發現Epo可修復內皮的連接咬合蛋白(α-連接蛋白、β-連接蛋白)，此作用可對抗TBI后的血管源性水腫。Epo還可限制水通道蛋白4(AQP4)介導的星型膠質細胞腫脹，腦水腫和神經系統癥狀。抑制神經型NO合酶(nNOS)的活性，減少相應NO的生成也是Epo減輕腦水腫的機制之一。同時，Epo可增強內皮型NO合酶的活性，促進該類NO的生成，從而舒張血管以改善血供，提高氧供。

3.5 減輕腦損傷后缺血部位的炎癥反應 Epo可降低TBI后相關的炎性因子如IL-1β、TNF-α、細胞間黏附分子(ICAM-1)的水平［22］。Epo的抗炎性效應很有可能是通過穩定血-腦脊液屏障，減輕腦損傷后的神經細胞死亡，而不是通過與表達EpoR的炎性細胞結合實現的，該過程還可減少損傷部位包括炎性因子在內的趨化因子的聚集。

3.6 誘導神經元修復 以上所述的機制都是Epo針對急性腦損傷所起的保護作用，損傷后的神經修復方面，Epo是否有作用呢?Epo可通過促進神經母細胞向腦損傷缺血區遷移，促使神經細胞的新生，加強神經功能的恢復。該作用很有可能與經PI3-K/Akt-1途徑調節基質金屬蛋白酶-9(MM9)、MM2蛋白激酶的分泌過程有關［23］。

4 Epo及EpoR的臨床應用與探討

編碼Epo的cDNA已被成功分離，重組人Epo(rhEpo)的研究也早已獲得成功。rhEpo主要用于治療腎性貧血和外科手術前的紅細胞動員，對新生兒貧血、癌相關貧血，免疫性疾病伴發的貧血也有治療作用。近年，越來越多的證據表明，Epo是一種多功能因子，外源性應用rhEpo可在機體損傷時對多種器官發揮保護作用，這一作用與骨髓造血無關。

雖然目前尚未有Epo用于治療TBI的臨床前瞻性研究，但是目前有一些資料間接提示外源性應用rhEpo可能對嚴重TBI的患者有效，與對照組比較，rhEpo治療組可顯著降低住院期間的死亡率［24］。Corwin等［25］在一項最初研究rhEpo能否減少危重病患者輸血率的大型臨床Ⅱ期試驗的后期亞組數據分析發現:皮下注射rhEpo有降低創傷患者死亡率的趨勢。這一結果促使研究者們進行了一項更大規模的Ⅲ期臨床前瞻性研究［26］，該研究人群涉及內科、外科手術和創傷危重病患者，并將Epo能否降低死亡率設為研究目標。實驗結果表明，相對于空白對照組，每周1次皮下注射rhEpo 40 000U(連續3周)可降低重癥創傷患者29d及140d的死亡率。從已知的動物實驗來看，rhEpo要發揮腦保護作用，其用量遠遠大于常規治療貧血的劑量，這樣就容易導致副作用如靜脈血栓。有限的臨床研究確實也發現大劑量應用rhEpo可導致靜脈血栓發生率明顯升高［26－27］。目前，臨床應用rhEpo的途徑、劑量、頻率還未有統一結論。可以肯定的是大劑量、長時間的應用是臨床應用的一大趨勢，而如何有效避免嚴重并發癥是其中的關鍵。目前有三項致力于評估Epo治療TBI安全性和有效性的試驗正在進行(NCT00260052;NCT00313716;NCT00375869)，相信將為臨床運用rhEpo治療TBI提供可靠的證據。同時，rhEpo分子起保護作用的區域已明確，非促紅細胞生成的Epo變構體(如氨基甲酰化Epo)可保留神經保護作用同時又無因刺激造血系統導致的并發癥［28］。Epo變構體正積極研制中，其臨床應用前景十分可觀，但在此之前仍需大量的試驗研究。

Liao等［15］發現小鼠體內EpoR水平在重型TBI后7d仍呈明顯升高，而Epo水平在短暫升高后恢復正常水平，該趨勢提示外源性應用rhEpo的可行性。動物體內Epo、EpoR的變化趨勢經多項實驗已基本明確，不過也僅限于顱腦損傷，近期有研究提示rhEpo對失血性休克的動物也有臟器保護作用［29－30］。那么，休克動物體內的Epo、EpoR的變化又是怎樣的趨勢?是與TBI類似，還是存在不同的規律?另外，Epo、EpoR的表達研究多限于動物實驗，人體內兩者的表達情況尚不明確。對于不同損傷程度及損傷類型的患者，Epo、EpoR的表達又有怎樣的不同，兩者的上升水平及持續時間是否與損傷程度、損傷類型有關?從已知的研究來看，EpoR的變化趨勢是機體的自我保護性應對策略，那么損傷后期EpoR的水平是否可作為提示預后的有效參數?筆者認為，只有解決了上述問題，才能為臨床應用rhEpo提供有力的理論依據，還能為臨床評估創傷患者預后提供可靠的指標。

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