核因子Y在植物中的分類及其功能概述

李文濱，李勝暢，王志坤

（1.東北農業大學農學院，哈爾濱 150030；2.大豆生物學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

植物生長在一個千變萬化的環境中，會受到干旱、低溫以及病原侵染等逆境脅迫，植物細胞在染色體DNA水平、轉錄水平以及轉錄后水平上對基因表達進行精確調控，以適應環境的變化[1]。受環境脅迫誘導表達的基因可分為兩類：一類是基因編碼的蛋白產物，使植物細胞直接具有抵御環境脅迫的功能，如胚胎后期發育豐富蛋白（LEA蛋白）、滲調蛋白、離子區域化和水通道蛋白、抗凍蛋白、脯氨酸、果聚糖合成酶及甜菜堿合成酶等；另一類是基因編碼的調控產物，在植物脅迫應答中具有信號傳導和調控基因表達的功能，如感應和傳導脅迫信號的CDPK、MAPK等蛋白激酶，以及參與調控基因表達的bZIP類、bHLH類、NAC類、DREB類、ERF類、RAV類、WRKY和MYB類等轉錄因子[2-3]。

轉錄因子（Transcription factor，TF）又稱反式作用因子，是能夠與基因啟動子區域中的順式作用元件發生特異性結合，從而保證目的基因以特定的強度、在特定的時間與空間表達的蛋白質分子相結合[4]。植物許多基因的表達都是由特定的轉錄因子與特定的順式作用元件相互作用調控的。

核因子Y是成員最多的植物特異轉錄因子之一。在酵母和哺乳動物中，其中每個亞基一般只有一個基因編碼。在植物中，每個亞基類已被大大擴展，分別由幾個或更多個基因編碼。這樣的家族擴展，提供了更多的NF-YA/NF-YB/NF-YC三聚體組合，并大量增加了核因子Y功能復雜的潛力，成為一個廣泛調控系統。這表明了不同的核因子Y在植物中比在其他生物中更復雜的調節作用。

1 植物核因子Y的結構特點及其分類

核因子Y是一種普遍存在的轉錄因子，由三個不同的亞基組成：NF-YA、NF-YB和NF-YC。在真菌和動物中，每一個亞基由一個基因編碼；而在植物中每個亞基是由多個基因編碼的。NF-YA亞基有兩個功能上很保守的核心結構域，N端結構域和NF-YB/C相互作用，C端結構域和DNA相互作用。NF-YB和NF-YC兩個亞基的保守結構域也包括一些和DNA相互作用的殘基。NF-YB主要對NF-YA與DNA的結合起促進作用[5]。NF-YB和NF-YC亞基包含有高度保守的蛋白折疊序（Histone-fold motif，HFM），并且結構上和核心組蛋白亞基H2B和H2A相似[6-8]。與植物、脊椎動物和酵母的NF-YA高度保守核心區相比，NF-YB和NF-YC亞基的核心序列不是保守的。

核因子Y是一種典型的通過和調控因子相互作用來調控下游基因表達的轉錄因子。NF-Y轉錄因子含有保守專一性的序列，該序列和真核生物啟動子區域的CCAAT框相結合。CCAAT盒是在真核啟動子中最常見的啟動子元件之一，它通常是位于60～100 bp的轉錄起始位點上游，并在正反兩個方向直接起作用[9-12]。在多物種中，無論是存在的位置、方向上，還是結合的核苷酸的數目上，CCAAT盒都是高度保守的同源基因序列[8]。在所有真核生物中，CCAAT盒轉錄調節組件是一個順式調控元件，并且存在于約30%的基因的啟動子區域[13]。基因表達模式可以是組織或階段特異性的，也可以由其他順式和反式作用因子決定，而由包含CCAAT盒的啟動子來控制基因的表達可能是無處不在的。多個反式作用因子與CCAAT盒相聯系，但只有核因子NF-Y是和CCAAT這5個核苷酸相結合[10]。

在真菌中，酵母（面包酵母）HAP由HAP2/3/5三個亞基組成，即HAP2（也稱為NF-YA或CBF-B）、HAP3（NF-YB/CBF-A）和 HAP5（NF-YC/CBF-C），結合CCAAT盒并控制靶基因的表達。每個亞基含有一個保守結構域，主要和DNA、蛋白質相結合。在雙子葉植物擬南芥中，HAP亞基的幾個成員是由愛德華茲等在1998年第一次鑒定得到的。基因組中編碼10個NF-YA/HAP2亞基基因，13個NF-YB/HAP3亞基基因，13個NF-YC/HAP5亞基基因[14]。在單子葉植物水稻中，克隆了10個HAP2亞基基因，11個HAP3亞基基因，7個HAP5亞基基因[15]，HAP2和HAP5亞基基因未被報道過，只對6個HAP3亞基基因做了詳細研究[16-17]。在小麥中有37個NF-Y亞基基因，包括10個NF-YA亞基基因，13個NF-YB亞基基因，14個NF-YC亞基基因，還有兩個Dr1蛋白，包括 Dr1（NC2b）和 Drap1（NC2a）[18]，分別和NF-YB、NF-YC相聯系[19]。在小麥中建立了整個基因組DNA分析研究的數據庫，根據保守的核心區域，每個NF-Y的亞基家族可進一步劃分為4～5個分支。通過比較小麥、水稻和擬南芥的核因子Y的成員結構，幾個保守結構域以外的NF-Y的核心區域也被確定出來[19]。

2 植物NF-Y轉錄因子的生物學功能

2.1 核因子Y在植物抗旱中的作用

陸生植物在克服干旱時會引起復雜的反應特性，但個別信號轉導通路調控表達已經成為一種調節植物抗旱性增強的良好策略。這種方法將適用于干旱地區種植的多種作物。這些作物已經證實通過功能基因組學的方法在擬南芥模式植物中確定新的克服干旱的途徑，并與作物生產實際應用相聯系。

擬南芥的nf-yb5基因在抗旱方面具有重要作用。擬南芥nf-yb5的轉錄受到抗旱的強烈誘導，主要在微觀組織和保衛細胞中高度表達，超表達擬南芥nf-yb5的植株在干旱脅迫時，表現為葉片失水減少，花青素含量增加，因而植株抗旱性大為提高[14]。在擬南芥中，LEC1、LEC1-like蛋白和NF-YB亞基蛋白，都被認為是對干旱反應起到至關重要的物質。在系統發育和功能上，擬南芥LEC1和LEC1-like蛋白又不同于NF-YB亞基蛋白。如擬南芥NF-YB1亞基很可能是一個非LEC1-like的NF-YB亞基，它和擬南芥LEC1和LEC1-like蛋白相關或者相重疊。在干旱條件下，擬南芥nf-yb1兩個獨立的T-DNA插入株系無法檢測和顯示對于干旱反應的變化。說明此基因是一種耐旱性的NF-Y轉錄因子。擬南芥nf-yb1基因的抗旱途徑是一種與報道公認的ABA抗旱途徑和CBF4途徑不同的新抗旱途徑[20]。

玉米nf-yb2被用來構建一種新型的轉基因玉米品種。它結合一段DNA區域，該區域是由水稻的actin1蛋白的組成型啟動子和內含子連接到玉米的基因上。轉基因玉米在抗旱方面表現突出[20]。在干旱條件下，轉nf-yb2基因玉米植株較野生型植株表現：葉片葉面積減小，葉片不萎蔫，葉片溫度低。葉綠素指數增高、光合速率增強、較高的氣孔電導率。過量表達擬南芥nf-yb1基因的轉基因玉米改善了玉米產量并且增強了植株的抗旱性[20]。

在全球，主要有四個小麥出口國（阿根廷、澳大利亞、加拿大和美國）在作物生長的中度至重度干旱的條件下擁有最大的小麥生產總量。這也是對小麥產量的主要非生物約束[21]。從模式植物擬南芥和水稻基因序列信息出發，從核苷酸序列數據庫中比對出所有小麥核因子Y的亞基成員，確定了NF-Y模式亞基基因家族，并確定了其基因的表達譜。小麥nf-y基因的表達普遍存在，NF-Y家族每一個亞基的基因成員主要在胚乳中表達。而其他一些基因在一特定器官中表達。通過定量RT-PCR分析顯示：在小麥葉片中，9個nf-y和2個dr1基因表達似乎對干旱脅迫反應起作用。這些基因中的三個基因在干旱條件下表達是上調的，說明了這些基因都可能與植物適應干旱有關。通過基因組合式表達及系統發育進化樹分析表明，在同一進化分支中各個成員普遍認同為一個類似的表達譜。器官特異性表達和對干旱的差異分析，轉錄因子家族各成員有特定的生物學作用。

干旱影響超過10%的耕地，減少了50%主要農作物的平均產量[22]。非生物脅迫嚴重影響產量，如植物細胞周期進程，代謝率和生理平衡許多生物過程。轉錄因子像個復雜的開關調控這些生理生化過程[23-24]。

2.2 核因子Y在植物胚胎發育和葉綠體功能形成中的作用

遺傳分析第一個植物核因子Y的基因LEAFY COTYLEDON 1（lec1）和LEAFY COTYLEDON 1 LIKE（l1l），它們在胚胎發育、種子成熟和編碼核因子-B類的旁系蛋白中起到關鍵作用[25-26]。擬南芥LEAFY COTYLEDON1（lec1）通過功能缺失突變分析和獲得性功能分析，被證明是一個胚胎發育調控的關鍵基因[27]。LEC1-like（lec1-like）是和lec1序列最相似的基因，也在擬南芥中控制胚胎發育[30]。在胡蘿卜中，C-lec1被證明是一個lec1同源基因，并在胚胎發育發揮類似的作用[29]。其他的NF-YB亞基蛋白，不屬于LEC1類，已被證明是一種新的基因調控子，參與葉綠體發育和干旱反應的重要調節[28-29]。

水稻（OsHAP3A-C）的三個亞基在植物體內普遍表達。抑制水稻hap3基因的表達導致葉綠體退化和光合作用途徑的基因下調表達，說明水稻hap3基因參與葉綠體的發育。目前，從反義RNA和RNAi試驗數據表明：在水稻中NF-YB一些亞基被推斷為參與葉綠體的功能形成。水稻hap3a基因和同源基因水稻hap3b、水稻hap3c顯示出了控制葉綠體的生物合成[17]。提出每個hap3基因具有專一的作用。相比之下，在植物中，hap2和hap5基因都沒有被深入地研究。有研究分析表明，三聚體HAP復合體在植物中組合成了CCAAT的結合識別序列[30-32]。

2.3 核因子Y在植物光合作用中的調節作用

最近，有證據顯示植物的所有三種NF-Y家族亞基成員活動的變化會影響開花時間。擬南芥NF-Y家族的NF-YB2（HAP3b）和密切相關的擬南芥蛋白NF-YB3（HAP3c）有著相似的功能，二者在開花誘導上都是必需的[33]。在光周期誘導的條件下，NF-Y復合體提供了DNA結構，能和CONSTANS蛋白結合，激活光周期途徑促進開花的重要下游組件轉錄促進開花，例如FT基因。進一步通過使用一個ELISA法為基礎的體外試驗表明，植物的NF-YB亞基能夠結合CCAAT盒啟動子元件并作為NF-YA（HAP2）和NF-YC（HAP5）三聚體亞基的一個特殊結構。越來越多的證據表明CCAAT框結合的核因子Y家族在調控開花時間中起作用。特別是NF-YB2亞基（HAP3b）已被證明通過促進開花的CO2（SOC1）表達（FT）[34-35]。雖然沒有試驗證據表明，CO有DNA結合活性，但CO及相關蛋白最近能夠在體外和體內研究，已顯示出能結合NF-YB和NF-YC亞基蛋白的特性，包括核因子-YB2系列[36-37]。因此，有可能NF-YB調節植物開花的影響，可以作為NF-Y復合體的一部分來直接與CONSTANS蛋白質相互作用。長日照條件下表型變化很明顯，并暗示了NF-YB2與CONSTANS的蛋白質在同一途徑相互作用，通過“光周期途徑”調節開花，并反對“自主”開花途徑[38]。

核因子Y家族的CCAAT盒結合蛋白在植物中實現了很多種NF-Y三聚體的組合，以一種正調控或者負調控的方式，任意數量的三聚體都可能影響開花時間。特別值得注意的是，另一種擬南芥的NF-YB亞家族的HAP3a（NF-YB1）成員，最近被證明抑制開花[37]。因此，NF-YB1可能在NF-YB2和NF-YB3促進開花上起到相反的作用。

鑒定NF-YA（HAP2）、NF-YC（HAP5）與NF-YB（HAP3）蛋白質，以及對于目標基因的結合位點，現在是一個具有挑戰性的任務，需要廣泛的遺傳與生物學的研究，所以提出DNA結合生化方法檢測。這很可能是具體的核因子Y的亞基和目標基因的結合來監管調控開花時間。如CO在特定的環境或生理條件下，將提供優良的光周期條件調控開花。除了植物核因子Y蛋白質在開花時間調控中的作用，這個家族已演變為一種調節植物生物學的重要方面，包括胚胎發育，光合作用和生理反應調節[29-30]。通過他們與其他調節蛋白互作，如CCTs，以及可能的大量亞基組合，核因子-Y家庭的DNA結合蛋白提供了許多關鍵的共同協調途徑。

3 植物核因子Y的研究方法

隨著植物功能基因不斷地深入研究，用來研究植物基因功能的方法也隨之增多，目前研究植物核因子Y功能的方法主要包括以下幾種。

3.1 瞬間表達分析方法

該方法是指植物轉錄因子瞬間表達分析，主要是針對轉錄因子與特定順式作用元件的結合及對其轉錄的激活或轉錄抑制效應的作用[39]。辣椒WRKY轉錄因子基因的瞬間表達分析，就是通過基因槍瞬間轉化技術將兩種載體共轉化洋蔥表皮細胞。檢測共轉化洋蔥表皮細胞中gus基因的表達情況，以此來分析轉錄因子與其特定的順式元件結合的作用及對其轉錄的激活效應。目前用得比較多的基因瞬間表達分析方法有酵母單雜交和酵母雙雜交。

3.2 植物基因功能突變分析方法

該方法包括基因功能的缺失突變和基因功能獲得性突變兩個方面，目前，基因功能的缺失突變研究方法主要包括T-DNA插入突變[40]、反義抑制、轉座子插入突變[41]。植物轉錄因子基因功能獲得性突變主要有基因超量表達和基因誘導表達兩種。

3.2.1 植物轉錄因子基因超量表達

該方法是指將轉錄因子基因全長序列與組成型強啟動子（花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子）融合，轉化受體材料，獲得目標基因產物過量表達的植株。超量表達擬南芥nf-yb1的轉基因植株在抗旱脅迫反應中較野生型植株表現明顯，而T-DNA插入突變的擬南芥nf-yb1的轉基因植株在抗旱脅迫中的反應表現不明顯。葉片明顯萎蔫，發黃[20]。擬南芥nf-ya5基因在干旱條件下，是個上調表達基因。對miR169前體物miR169a和miR169c的表達分析顯示：在干旱情況下，miR169a和miR169c下調表達。擬南芥nf-ya5包含有miR169結合位點，與目標mRNA結合抑制基因的轉錄。在依賴于ABA的干旱脅迫途經下，miR16下調表達。擬南芥nf-ya5基因敲除植株和miR16a基因敲除植株顯示了葉片嚴重失水，轉基因植株比野生型植株更敏感。相比之下，過量表達擬南芥nf-ya5基因植株比野生型植株對干旱反應不是很敏感，表現葉片失水減少，野生型植株葉片失水嚴重，出現萎蔫和發黃狀態。基因芯片分析表明，擬南芥nf-ya5是干旱反應的至關重要表達的數量基因。因此，擬南芥nf-ya5抗旱能力是很重要的，其誘導干旱脅迫都發生在轉錄和逆境的水平[14]。但該方法得到的目標基因產物的超量表達往往是致死效應，從而很難從表型上正確判斷和評價目標基因對植株的真實影響，因而這種方法具有很大的局限性[42]。

3.2.2 植物轉錄因子基因誘導表達

植物轉錄因子基因誘導表達可以實現基因表達的時間控制，可以避免如基因超量表達引起的致死效應和多重效應的局限，因而可以成為基因功能獲得性研究中一種非常有效的方法。利用熱擊蛋白的表達特性是最先出現的基因誘導表達系統。在熱擊的情況下，熱擊蛋白的啟動子會啟動其下游基因序列的表達，將目標基因與該啟動子相結合，在熱擊的情況下即可以實現對目標基因的時空表達的控制，即所謂的HS（Heat-shocking）系統[43]。之后又建立起其他的誘導表達系統，又如依賴于四環素的tTA表達系統，四環素反式激活蛋白（tTA）是一個包含大腸桿菌TN10（編碼四環素的抑制子）和單純皰疹病毒P16蛋白（VP16）C端部分的融合蛋白，它能夠促進由7個tet操縱子和一個TATA-box組成的人工啟動子控制的報告基因（如gus基因）的轉錄，在四環素及其衍生物的條件下，四環素能夠干擾tTA與操縱子DNA的結合。tTA無法與其靶位點相互作用，從而極大地減少報告基因的表達，轉錄也就無法進行。四環素這種嚴謹的表達調控誘導系統在細胞水平和轉基因中被廣泛用來研究基因的功能。這一系統可用于對那些可能產生致死產物的基因進行轉基因研究[44]。如依賴于銅離子的表達系統，這是一種根據酵母MT（Metallothionein，金屬硫）基因的調控原理構建的應用于植物的基因表達系統。該系統中銅離子的濃度直接作用于組合式啟動子的活性，因此可以用于基因的適時精確表達實驗中。目前，已經有大量的實驗表明：這些誘導系統中，用得最多的是GR系統，可以成功地應用于研究植物（雙子葉植物和單子葉植）轉錄因子的功能。

3.3 基于糖皮質激素受體系統的基因誘導表達

糖皮質激素受體系統（GR）的基因誘導表達，已經被證實是研究基因功能和植物轉錄因子非常有效的誘導表達系統。它利用了GR的調控機制，即在沒有配基（如DEX，地塞米松）的情況下，GR的配基結合功能區與其相連的蛋白分子相結合，從而封閉該GR的配基蛋白分子的結合，其功能就會失去；但在有GR的配基存在的條件下，其功能又可以恢復[45]。

3.4 RNA干涉（RNAi）

近幾年發展起來的RNAi技術，作為一種高效、特異的代替基因敲除的遺傳工具，此技術正在加速改變著功能基因組學領域的研究[46]。

4 結語

核因子Y功能多樣，它們參與調節植物生物學的重要方面，包括胚胎發育、光合作用、葉綠體發育和干旱反應等重要生理過程。目前，在數量眾多的NF-Y轉錄因子中，功能明確的只占很少一部分，大部分NF-Y轉錄因子的研究尚處于基因克隆、結構鑒定和表達分析等層面上。對于植物核因子Y復合物的生物學功能，人們了解的還不是很清晰。NF-Y轉錄因子的下游目標基因和上游調控因子更是知之甚少。但是，相信隨著RNAi、反義RNA等技術和miRNA的不斷發展和應用以及NF-Y蛋白同DNA與其他蛋白相互作用的深入研究，將會進一步明確NF-Y轉錄因子的生物學功能，其調控網絡也會逐漸清晰。

*感謝農業部大豆產業科技研發中心和黑龍江省教育廳創新團隊對本試驗的支持。

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