針刺對神經(jīng)干細(xì)胞海馬內(nèi)移植癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的影響*

楊春壯，徐永良，陸 迪，馬彥文，關(guān)艷中，趙 微

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011)

老年性癡呆(AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和學(xué)習(xí)記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，尚缺乏有效的治療方法。神經(jīng)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的存在并體外培養(yǎng)成功，為神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病的研究提供了一種新的治療策略。而針刺對神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植后的影響文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用β－AP向海馬CA1區(qū)定向注射制做AD模型，利用體外分離培養(yǎng)的NSCs移植入AD大鼠，探討NSCs移植后針刺對AD大鼠大腦皮層和海馬膽堿能系統(tǒng)的影響。

1 材料和方法

1．1 儀器和試劑

腦立體定位儀(68001型，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，ZH－200型大鼠光電刺激跳臺(tái)(安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo熱電上海儀器有限公司)，ChAT酶聯(lián)免疫試劑盒(上海勁馬生物科技有限公司)，β－AP(美國Sigma公司)。

1．2 AD動(dòng)物分組及模型的制備

健康成年雄性 Wistar大鼠60只，體重(300±50)g，隨機(jī)分為5組，正常對照組(正常組)12只，其余單側(cè)(左側(cè))海馬注射β－AP制作AD模型。制造癡呆模型后，將其隨機(jī)分成4組:模型組12只，針刺組12只，NSCs移植組(移植組)12只，移植后針刺組(移植針刺組)12只。

模型制備:大鼠用20%烏拉坦(0．55 ml/kg)行腹腔注射，按腦立體定位圖譜(AP=2．22 mm ML=3．0 mm DR=2．8 mm)向海馬注射1μlβ －AP(恒溫培養(yǎng)箱37℃卵育1周，臨用前生理鹽水配制成5μg/μl濃度)。緩慢勻速推注，時(shí)間不少于5 min，再留針3 min。正常組不注射。

1．3 NSCs的分離和純化及海馬內(nèi)NSCs移植

參照相關(guān)文獻(xiàn)［1］方法進(jìn)行。坐標(biāo)為:AP=2．22 mm ML=3．0 mm DR=2．8 mm。

1．4 針刺選穴及方法［2］

電針百會(huì)、大椎、人中。百會(huì)位于頂骨正中;大椎位于第7頸椎與第1胸椎間，背部正中;人中位于唇裂鼻尖下1 mm正中處。針刺組和移植針刺組用0.32 mm×25 mm毫針針刺。采用KWD－808Ⅱ型全能脈沖電療儀(青島生產(chǎn))，頻率10 Hz，電壓1．5 V，疏密波，以大鼠安靜耐受為度，強(qiáng)度約為2 mA。留針10 min，持續(xù)電刺激，每天1次，共治療30天。

1．5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

針刺后進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，24 h后重復(fù)測試，作為動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶成績的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠放入裝置中，適應(yīng)環(huán)境5 min。以首次測試5 min之內(nèi)大鼠逃到安全臺(tái)上，再從安全臺(tái)跳下的次數(shù)為學(xué)習(xí)成績，24 h后重復(fù)測試，5 min之內(nèi)大鼠逃到安全臺(tái)上，再從安全臺(tái)跳下的次數(shù)為記憶成績。

1．6 ChAT 的檢測

跳臺(tái)測試完畢后，大鼠禁食過夜，將大鼠斷頭后在冰面上迅速取腦，分離大腦皮層和海馬，生理鹽水沖洗后，稱重，制備成10%的組織勻漿，將勻漿液置于離心機(jī)2000 r/min離心20 min，取上清待測ChAT。ChAT的檢測嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，單因素方差分析進(jìn)行多組間均數(shù)比較，組內(nèi)用t檢驗(yàn)，P＜0．05為顯著水平。

2 結(jié)果

2．1 針刺對各組大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

表1 針刺對各組大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(±s)

表1 針刺對各組大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(±s)

注:與模型組比較，1)P ＜0．05;與正常組比較，2)P ＜0．05;與移植組比較，3)P ＜0．05。

12 13．5 ±2．5 10．8 ±3．4模型組 12 34．4 ±5．32) 31．5 ±6．12)移植組 12 22．6 ±1．81) 15．9 ±2．51)針刺組 12 25．8 ±6．31) 18．6 ±4．41)移植針刺組 12 15．3 ±3．61)3) 9．2 ±2．11)3)組別 例數(shù) 學(xué)習(xí)所需次數(shù) 記憶所需次數(shù)正常組

表1顯示，模型組與正常組比較，學(xué)習(xí)、記憶所需次數(shù)明顯增多(P＜0.05)，說明癡呆模型制造成功;治療30天后，針刺組、移植組和移植針刺組與模型組比較，次數(shù)顯著減少(P＜0.05);而移植針刺組與移植組相比較，次數(shù)顯著減少(P＜0.05)，說明針刺和移植聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

2．2 針刺后各組大鼠皮層、海馬ChAT含量的定值比較

表2 針刺后各組大鼠皮層、海馬ChAT含量的定值比較(±s，n=12)

表2 針刺后各組大鼠皮層、海馬ChAT含量的定值比較(±s，n=12)

注:與模型組比較，1)P ＜0．05;與正常組比較，2)P ＜0．05;與移植組比較，3)P ＜0．05。

71．583 ±17．731 75．167 ±25．83模型組 32．383 ±10．4872) 23．49 ±13．082)移植組 57．375 ±6．59111) 42．95 ±12．431)針刺組 55．371 ±17．8531) 50．93 ±20．631)移植針刺組 67．575 ±14．8721)3) 64．08 ±46．081)3)組別 皮層 海馬正常組

表2顯示，模型組與正常組比較，皮層、海馬的ChAT含量明顯降低(P＜0.05);30天后，針刺組、移植組和移植針刺組與模型組比較，顯著提高(P＜0.05);而移植針刺組與移植組比較，顯著增加。

3 討論

經(jīng)驗(yàn)證，針灸療法對AD療效肯定，尤其是電針療法應(yīng)用最為廣泛。電針療法對神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的特殊作用使它在腦部疾病治療領(lǐng)域上具有特殊優(yōu)勢。

中醫(yī)文獻(xiàn)中無“老年性癡呆”的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)認(rèn)為本病屬中醫(yī)“呆病”、“健忘”、“癲證”等范疇。其病因病機(jī)為肝腎虧虛、氣滯血瘀，以腎氣虛衰、髓?？仗?、腦神失養(yǎng)為其根本。百會(huì)和大椎均屬督脈穴位，百會(huì)為“三陽五會(huì)”，大椎為“諸陽之會(huì)”，為手足諸陽之會(huì)。督脈與腦密切相關(guān)，督脈通于腦。人中位于鼻下嘴上，正是“諸陽之海”的督脈與“諸陰之?！钡娜蚊}交會(huì)點(diǎn)。針刺此三穴可以激發(fā)經(jīng)氣，疏通經(jīng)絡(luò)，使腦髓得氣血之榮養(yǎng)而復(fù)聰。

膽堿能學(xué)說在AD發(fā)病機(jī)理的諸種假說中影響最廣泛，學(xué)術(shù)界普遍接受［3］。中樞膽堿能通路是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的重要通路。乙酰膽堿(ACH)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，是迄今發(fā)現(xiàn)的與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最密切的一種神經(jīng)遞質(zhì)。ChAT為膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)ACH的合成酶，常用來做為膽堿能活性指標(biāo)［4～5］。通過檢測治療前后腦組織中ChAT含量，即可推測出ACH的含量，從而判斷老年性癡呆鼠的智能及記憶損害程度。

資料結(jié)果顯示，神經(jīng)干細(xì)胞移植到腦內(nèi)不同部位后，能夠根據(jù)宿主腦內(nèi)的微環(huán)境分化為不同腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞［6－8］。本研究中移植的神經(jīng)干細(xì)胞使大腦皮層和海馬的膽堿能神經(jīng)元及功能得到明顯改善和增強(qiáng)，從而提高其學(xué)習(xí)記憶能力。模型組大鼠大腦皮層和海馬內(nèi)ChAT活性明顯低于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示兩者有顯著性差異(P＜0．05)，提示腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元損傷，功能降低，ACH合成率下降的原因可能是CHAT活性下降，因而造成學(xué)習(xí)記憶功能缺損。經(jīng)電針治療后，ChAT活性升高，調(diào)節(jié)了ACH生理代謝，改善了膽堿能系統(tǒng)的功能，從而改善了認(rèn)知障礙，達(dá)到治療VD的目的。同時(shí)結(jié)果還顯示，神經(jīng)干細(xì)胞移植后再進(jìn)行針刺對大腦膽堿能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)效果更好。

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