人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)外周靜脈移植治療失代償期肝硬化的療效和安全性研究

王娟 郭慶 邵麗春 武威 宋業(yè)朋 王孟巖 張軍 陳哲 周波 莊玲

失代償性肝硬化嚴(yán)重危害人類的健康，雖然肝移植是目前最有效的治療方法，但由于供肝的缺乏，手術(shù)技術(shù)的復(fù)雜和費用的昂貴及術(shù)后的免疫排斥等因素限制了其開展的規(guī)模，細胞治療的研究為肝硬化的治療帶來新的治療前景。2010年12月至2011年8月，我們采用經(jīng)周圍靜脈移植人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)治療失代償期肝硬化21例，以觀察移植術(shù)后臨床癥狀和肝功能的改善及安全性，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年12月至2011年8月我科收治的失代償期乙型肝炎肝硬化患者21例，Child-Pugh分級C級，診斷符合2005年《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)。其中男19例，女2例;年齡39～56歲，平均年齡(46±8)歲;平均病程(9±7)年。無感染、活動性上消化道出血、嚴(yán)重肝昏迷、肝腎綜合征、肝癌患者。CT、核磁共振(MRI)或彩超影像學(xué)檢查均為重度肝硬化、脾大、門脈高壓患者，經(jīng)過內(nèi)科治療療效差。實驗室檢查包括血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TB)、凝血酶原時間(PT)、白蛋白(ALB)、纖維蛋白原(FBG)、白細胞、血小板。同時給予綜合基礎(chǔ)治療。經(jīng)過醫(yī)院器官倫理委員會審查批準(zhǔn)，在患者知情同意的情況下，簽定《知情同意書》。隨訪患者至HUCMSCs移植后第12周。

1.2 臍帶間充質(zhì)干細胞制備 UCMSCs懸液由深圳北科生物科技有限公司用靜脈內(nèi)膜酶消化法分離、培養(yǎng)、擴增、純化后提供，干細胞濃度(2 ～5)×107/ml，懸液量30 ml。

1.3 移植途徑及方法 患者取仰臥位，采用外周靜脈途經(jīng)使用輸血器輸注，取肘正中靜脈穿刺先用0.9%氯化鈉溶液建立靜脈通道，再連接復(fù)溫的細胞袋輸注UCMSCs懸液。滴入的時候注意控制滴速，30 ml懸液滴注10 min，再滴入0.9%氯化鈉

1.4 術(shù)后觀察 術(shù)后 2、4、8、12 周觀察 ALT、TB、PT、ALB、FBG、白細胞、血小板水平變化，觀察臨床癥狀(食欲、精神、體力、腹脹、腹水、下肢水腫)改善情況及不良反應(yīng)。移植后4、8、12周行對肝膽脾行CT、核磁共振(MRI)或彩超影像學(xué)檢查

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植成功率及不良反應(yīng) 21例患者均成功輸入HUCMSCs懸液，除2例有低熱外，無呼吸困難、靜脈炎等其他并發(fā)癥發(fā)生。

2.2 實驗室指標(biāo) 經(jīng)外周靜脈移植HUCMSCs后肝功指與移植前比較均有好轉(zhuǎn)(P＜0.05)，白細胞和血小板與移植前比較也有明顯改變(P＜0.05)。見表1、2。

表1HUCMSCs移植前后實驗室檢測結(jié)果n=21，±s

表1HUCMSCs移植前后實驗室檢測結(jié)果n=21，±s

注:與移植前比較，*P ＜0.05

?

表2 HUCMSCs移植前后白細胞及血小板變化n=21，×109/L，±s

表2 HUCMSCs移植前后白細胞及血小板變化n=21，×109/L，±s

注:與移植前比較，*P ＜0.05

?

2.3 癥狀、體征改善情況 移植后大部分患者的臨床癥狀和體征有所改善，12周時改善明顯。改善率分別為食欲改善15/21(71.4%)、精神好轉(zhuǎn) 16/21(76.2%)、體力增加 12/21(57.1%)、腹脹減輕 11/21(52.3%)、腹水減少或消失 11/21(52.3%)，下肢水腫減輕或消失 10/21(47.6%)。

2.4 術(shù)后影像學(xué)表現(xiàn) 移植后4、8、12周肝膽脾CT、核磁共振(MRI)或彩超影像學(xué)檢查結(jié)果顯示患者的左右肝葉大小和食道靜脈曲張無顯著改變。

3 討論

3.1 HUCMSCs作為干細胞治療肝硬化的可行性 肝細胞損傷后再生修復(fù)主要來源于三種細胞系，肝細胞、肝內(nèi)干細胞、肝外干細胞［1］。作為肝外干細胞源干細胞治療方法［2］，使用HUCMSCs移植治療終末期肝硬化正成為一個研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)HUCMSCs在體外適宜的條件下可向靶細胞轉(zhuǎn)化。在肝細胞生長因子(HGF)、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子和其他細胞因子的刺激下，通過特殊的信號通路分化成形態(tài)、表型與肝細胞相似的細胞，并具備肝細胞的功能，移植后這些功能可以隨之轉(zhuǎn)移到受者［3］。間充質(zhì)干細胞具有自我更新和擴增的能力細胞，大量存在于臍帶，并可以從中提取并具有低免疫原性特征［4］。雖然骨髓間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于臨床治療終末期肝硬化較早，由于骨髓抽取有創(chuàng)，增加了患者痛苦及治療過程的風(fēng)險［5］。而HUCMSCs具有來源豐富、獲取無創(chuàng)等優(yōu)點，成為干細胞治療肝硬化的研究方向。21例患者輸入HUCMSCs懸液均獲得成功，低熱2例，無其他不良反應(yīng)，安全可行。

3.2 HUCMSCs移植治療效果 本組病例在選擇上除外了感染、活動性上消化道出血、嚴(yán)重肝昏迷、肝腎綜合征、肝癌患者，為干細胞進入人體后供較好的生長環(huán)境。從表1 HUCMSCs移植后肝功各項指標(biāo)的檢測結(jié)果可見，移植后4、8.12周ALT、TB下降與移植前比較明顯，PT移植后8、12周與移植前有顯著縮短，ALB、FBG在移植后4、8、12周顯著上升。以上指標(biāo)與移植前比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。從表2可見患者外周血白細胞及血小板水平在移植后8、12周較術(shù)前上升明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗結(jié)果表明使用HUCMSCs經(jīng)外周靜脈移植治療肝硬化可明顯改善失代償期肝硬化患者的部分癥狀和體征，使實驗室指標(biāo)好轉(zhuǎn)。而對患者的肝臟的體積和食道靜脈曲張近期無改善。

3.3 間充質(zhì)干細胞移植途經(jīng)選擇 本組病例采用經(jīng)外周靜脈輸注移植，優(yōu)點是簡單、安全。但HUCMSCs要經(jīng)過全身血液循環(huán)才能到達肝臟，對肝臟定居分化的細胞數(shù)量可能會有影響。與經(jīng)股動脈穿刺肝動脈插管輸注相比，細胞未能直接到達肝臟，但輸入操作風(fēng)險較小，并發(fā)癥發(fā)生率低，結(jié)果證實療效可靠。

3.4 HUCMSCs用于干細胞治療肝硬化的優(yōu)點 HUCMSCs來源于臨床分娩后廢棄的臍帶，其來源廣泛，取材方便，數(shù)量充足。干/祖細胞更原始，增殖能力強，無致瘤性，易于控制病毒、病原微生物感染及傳播，無醫(yī)學(xué)倫理道德問題。經(jīng)處理后，可獲得大量的間充質(zhì)干細胞，可在體外大量擴增并保持未分化狀態(tài)，免疫原性低，具有向肝細胞分化的潛能。

本研究從臨床角度證實HUCMSCs移植可以改善肝硬化患者的部分癥狀和體征及部分肝功能指標(biāo)，但由于研究的樣本小、指標(biāo)少、觀察時間短，HUCMSCs移植治療終末期肝硬化的長期療效及不良反應(yīng)還需要更多循證醫(yī)學(xué)的證實。

1 Weber A，Groyer-Picard MT，F(xiàn)ranco D，et al.Hepatocyte transplantation in animal models.Liver Transpl，2009，15:7-14.

2 Yagi K，Kojima M，Oyagi S，et al.Application of mesenchymal stem cells to liver regenerative medicine.Yakugaku Zasshi，2008，128:3-9.

3 Campard D，Lysy PA，Najimi M，et al.Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells.Gastroenterology，2008，134:833-848.

4 任紅英，趙欽軍，邢文，等.臍帶間充質(zhì)干細胞體外分化為有功能的低免疫原性肝細胞樣細胞.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2010，32:190-194.

5 Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived form adult marrow.Natur，2002，418:41-49.