慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4的變化及其與IL-6的關(guān)系

閻雙緩 唐亞芳 陳翠英 王素平 宋海燕 耿建章 劉玉珍 戴二黑 盧建華

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是連接天然免疫及獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁［1］，其中TLR4主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上，它識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)而引起機(jī)體特異性免疫反應(yīng)。本研究以HBV攜帶者和慢性乙型肝炎患者(CHB)為對(duì)象，觀察其外周血單核細(xì)胞表面TLR4受體表達(dá)水平，探討TLR4在慢性乙型肝炎中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年2月至2011年2月石家莊市第五醫(yī)院門診及住院慢性HBV感染者共95例，其中HBV攜帶者30例(HBV攜帶組)，其中男19例，女11例;年齡19～69歲;CHB患者65例(CHB患者組)，男42例，女23例;年齡35～76歲。診斷符合2000年西安會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。排除其他HAV、HCV、HDV、HEV或HIV的合并感染及肝硬化、肝癌等失代償肝病患者，近3個(gè)月未用過抗病毒藥物及糖皮質(zhì)激素等影響免疫功能的藥物。對(duì)照組為健康成人30例，其中男18例，女12例;年齡22～66歲。3組一般資料具有均衡性。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞TLR4:取EDTA抗凝血細(xì)胞懸液100 μl，分別加入 APC-anti-CD14單抗10 μl和 PE-anti-TLR4單抗 10 μl，室溫放置 30 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光靜置 15 min，離心，1 000 μl PBS 液震蕩洗滌 2 次，不加抗體設(shè)置陰性對(duì)照。離心棄去保存液，所得細(xì)胞以PBS液調(diào)整濃度至2×109/L，將標(biāo)本置于流式細(xì)胞儀上，以APC-anti-CD14陽(yáng)性設(shè)門，共獲取門內(nèi)10 000個(gè)單核細(xì)胞。經(jīng)Cellquest統(tǒng)計(jì)軟件分析，獲取直方圖，以平均免疫熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)表示TLR4的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)血清IL-6水平:無菌采集靜脈血5 ml，常規(guī)離心后取上清液，－80℃冰箱保存，待測(cè)。ELISA試劑盒是晶美生物有限公司分裝的美國(guó)Genzyme公司產(chǎn)品。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析和Scheffe檢驗(yàn)及線性相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)水平 CHB患者組與對(duì)照組及HBV攜帶組比較，TLR4水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HBV攜帶組與對(duì)照組比較，TLR4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 血清IL-6水平 對(duì)照組、HBV攜帶組及CHB患者組外周血IL-6水平依次升高，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 ＜0.01)。見表 1。

表1 3組病例外周血單核細(xì)胞TLR4與血清IL-6水平±s

表1 3組病例外周血單核細(xì)胞TLR4與血清IL-6水平±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與 HBV 攜帶組比較，△P ＜0.05

?

2.3 外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)水平與血清IL-6水平的關(guān)系 HBV攜帶組外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6表達(dá)水平無相關(guān)性(r=－0.775，P=0.375);CHB患者組外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6水平呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(r=0.674，P＜0.01)。

3 討論

免疫介導(dǎo)的肝損傷是多種慢性肝病的主要發(fā)病機(jī)制，TLRs信號(hào)系統(tǒng)可能在肝細(xì)胞損傷中起重要作用。其中TLR4的識(shí)別譜較廣，生物學(xué)作用廣泛，在乙型肝炎發(fā)病中的作用是一個(gè)值得探討的問題［3］。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血單核細(xì)胞TLR4水平高于健康人，且外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6水平存在密切關(guān)系，與尉秀清等［4］研究結(jié)果一致。目前關(guān)于TLR4表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究還比較少。內(nèi)毒素是TLR4最重要的配體，體內(nèi)內(nèi)毒素等刺激信號(hào)以及IL-6高水平的表達(dá)可導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞TLR4高水平的表達(dá)［4，5］。內(nèi)毒素血癥在乙型肝炎中的意義日益受到重視［6，7］，在CHB患者體內(nèi)存在內(nèi)毒素、凋亡細(xì)胞等TLR4刺激信號(hào)［8，9］，有可能導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞對(duì)上述刺激信號(hào)產(chǎn)生過度反應(yīng)，以及單核細(xì)胞IL-6高水平表達(dá)。IL-6可以通過多種信號(hào)通路導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死，在慢性乙型肝炎血清IL-6的水平與病情進(jìn)展有關(guān)，與肝臟炎癥程度相關(guān)［10，11］。總之，CHB患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6表達(dá)水平可以互相影響，呈現(xiàn)正相關(guān)，從而在CHB發(fā)病中發(fā)揮一定作用。

研究亦發(fā)現(xiàn)，HBV攜帶者與正常人外周血單核細(xì)胞TLR4水平無明顯差異，HBV攜帶者IL-6水平高于正常人，CHB患者IL-6水平高于HBV攜帶者，與田華［12］的研究結(jié)果一致。表明IL-6水平與病毒復(fù)制有關(guān)，更與肝細(xì)胞受損的程度有關(guān)。慢性HBV攜帶者IL-6水平升高，但不足以誘發(fā)大量TLR4產(chǎn)生，這也正是此類患者肝功能保持相對(duì)穩(wěn)定的原因。

1 Medzhitov R，Preston-Hurlburt，Janeway CA.A human homologuw of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity.Nature，1997，388:384-397.

2 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)與感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南.中華內(nèi)科雜志，2006，45:162-170.

3 Iwasaki A，Medzhitov R.Toll-like receptor control of the adaptive immune responsies.Nat Immunol，2004，5:987-995.

4 尉秀清，郭云蔚，文卓夫，等.慢性重型乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4的變化及其與IL-6的關(guān)系.中國(guó)病理生理雜志，2007，23:1563-1565.

5 Tamandl D，Bahrami M，Wessner B，et al.Modulation of toll-like receptor 4 expression on human monocytes by tumor necrosis factor and interleukin–6 tumor necrosis factor evokes lipopolysaccharide hyporesponsiveness whereas interleukin-6 enhances lipopolysaccharide activity.Shock，2003，20:224-229.

6 韓德五主編.腸源性內(nèi)毒素血癥與肝病.第1版.北京:中國(guó)科技出版社，2004.868-869.

7 李紅，韓德五，張素美，等.乙型肝炎患者腸源性內(nèi)毒素血癥、高組胺血癥與細(xì)胞免疫功能之間的關(guān)系.中國(guó)病理生理雜志，2006，22:559-562.

8 Lucas M，Stuart LM，savill J，et al.Apoptotis cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion.J Immunol，2003，171:2610-2615.

9 Sozinov AS.Systemic endotoxemia during chronic viral hepatitis.Bull Exp Biol Med，2002，133:153-155.

10 張偉英，楊利華，卓凌，等.慢性乙型肝炎患者血清TNF、IL-6、IL-10水平及其臨床意義.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31:595-596.

11 陳瑞烈，王文鋒，周震，等.重型乙型肝炎血清IL-1、IL-6和TNF-α水平的變化研究.臨床肝膽病雜志，2005，21:273-274.

12 田華.乙肝病毒感染者血清3種細(xì)胞因子水平及其臨床意義.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，1:136-137.