Ezrin在胃癌組織中的表達及與P-gp、GST-π、LRP的關系

張文軍 孫利梅 楊洪穎 左燕紅 李茂恒 屈志鋼

胃癌細胞具有較強的多藥耐藥性(multidrugs resistance，MDR)，這是導致胃癌綜合治療效果不佳的重要原因［1，2］。迄今為止，已發現有多種MDR相關蛋白質與胃癌MDR有關，但這些蛋白質都不能全面解釋胃癌MDR現象，尋找新的與胃癌MDR相關的因子對探討MDR機制、尋找MDR逆轉靶點有重要意義。埃茲(Ezrin)基因是新近發現的與許多惡性腫瘤關系密切的新基因，可影響多種惡性腫瘤的侵襲和轉移，在胃癌中也發揮重要作用［3－5］。研究顯示，Ezrin蛋白還與腫瘤MDR有關，但Ezrin蛋白是否與胃癌MDR有關及其作用的機制尚未見報道。故本研究檢測了Ezrin蛋白和與腫瘤MDR關系密切的P-gp、GST-π、LRP在胃癌中的表達，并對其關系和意義進行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2006年10月至2009年10月在我院手術并經病理證實的胃癌患者的石蠟標本52例，其中36例有癌旁組織石蠟標本。所有患者均為初診手術，腫瘤均為原發性胃癌，術前均未接受任何治療。其中男38例，女14例;年齡29～75歲，平均年齡(57±10)歲。兔抗人Ezrin、LRP多克隆抗體、鼠抗人P-gp、GST-π單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術公司。

1.2 免疫組化染色(SP 法)測定 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP 蛋白表達 石蠟包埋標本4 μm連續切片后進行HE和免疫組化染色。切片脫蠟水化，3%過氧化氫孵育、蒸餾水沖洗，以PBS浸泡后進行抗原修復。以下嚴格按試劑盒說明操作:工作液封閉、加入一抗、孵育并沖洗后依次加二抗工作液、辣根酶標記鏈酶卵白素工作液。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹脂封片。

1.3 免疫組化結果判定 染色結果由兩位病理學醫師進行雙盲閱片判斷結果。每張切片隨機取5個高倍視野(×400)，每視野均計數100個細胞，計算細胞的陽性率。Ezrin、P-gp、GST-π、LRP主要表達在細胞膜和細胞漿內，以出現黃色或棕黃色顆粒為染色陽性。記分標準:細胞內無陽性表達為(－)，＜50%細胞陽性表達為(+)，≥50%細胞陽性表達為(++)。

1.4 統計學分析 應用SPSS 15.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，各因子間的關系采用Spearman相關分析并計算相關系數，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌和癌旁組織中Ezrin、P-gp、GST-π、LRP蛋白表達情況52例胃癌組織中 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP陽性表達率分別為77.8%、62.2%、73.3%、71.1%;癌旁組織 4 種蛋白表達陽性率分別為 26.7%、77.8%、35.6%、37.8%。經比較，Ezrin、P-gp、GST-π、LRP在胃癌組織中的表達均較癌旁組織增強(P＜0.05)。見表 1、圖 1。

表1 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP在胃癌和癌旁組織中的表達 例

圖1 胃癌組織Ezrin、P-gp、GST-π、LRP的表達(SP×200)

2.2 胃癌和癌旁組織中Ezrin、P-gp、GST-π、LRP蛋白表達的關系 Spearman相關分析結果顯示，胃癌組織中Ezrin與P-gp表達存在正相關關系(r=0.3385，P=0.0141)，Ezrin與 LRP 表達存在正相關關系(r=0.3072，P=0.0267)，Ezrin 與 GST-π表達無明顯相關關系(r=0.2449，P=0.0801);P-gp與 LRP表達存在正相關關系(r=0.2986，P=0.0315)，P-gp 與 GST-π、GST-π與LRP之間表達均無明顯相關關系(r=0.2275，P=0.1048;r=0.1668，P=0.2373)。

3 討論

胃癌是我國病死率最高的惡性腫瘤，該病進展快、預后差，總體5年生存率不超過40%。化療是胃癌的重要治療手段之一，但由于胃癌細胞具有較強的多藥耐藥性(MDR)［1，2］，造成化療效果差，腫瘤易于復發、轉移。迄今關于腫瘤MDR的研究已近40年，發現了多種與MDR有關的蛋白質，逆轉MDR的藥物也已開始應用，但一直未能發現在胃癌細胞中起關鍵作用的蛋白質。因此，尋找新的影響胃癌MDR的蛋白質對探討胃癌MDR機制、確定MDR逆轉靶點有重要意義。Ezrin蛋白在細胞的生長過程中發揮重要作用，并且具有調節細胞信號轉導、粘附狀態等功能［6］，在包括胃癌在內的多種腫瘤中存在過表達，與腫瘤的侵襲轉移密切相關［2－4］。本結果顯示，Ezrin蛋白在胃癌組織中表達高于癌旁組織，說明Ezrin蛋白表達與腫瘤發生、進展有關，與其他報道結果符合。近年來還發現，Ezrin蛋白還與腫瘤的 MDR有密切的關系［5］，抑制 Ezrin蛋白對腫瘤的MDR特性有逆轉作用。因此，本研究進一步檢測了與胃癌MDR關系密切的P-gp、GST-π、LRP在胃癌組織中的表達，并分析了它們與胃癌MDR的關系。

P-gp是目前研究最多的與MDR相關的蛋白質，它定位于腫瘤細胞膜上，可以通過“藥泵”作用把化療藥物從細胞內泵出，導致腫瘤細胞對化療藥物產生抵抗［6］。GST-π則可以通過解毒作用把對細胞有殺傷作用的化療藥物水解為無害物質，造成腫瘤化療效果減弱［7］。LRP具有與P-gp類似的作用，該蛋白激活時可以阻止藥物進入細胞核，也可以把進入核內的藥物泵出核外，并儲存于細胞質的囊泡中，最終通過胞吐作用排出細胞外，從而導致 MDR［8］。本研究顯示，P-gp、GST-π、LRP 在胃癌組織中的表達均較癌旁組織增強，說明胃癌細胞具有較強的MDR特性，對化療藥物的敏感性差。分析Ezrin蛋白與P-gp、GST-π、LRP 的結果顯示，Ezrin 蛋白與 P-gp、LRP 均存在正相關關系，說明在胃癌MDR中，Ezrin蛋白可能通過影響P-gp、LRP的表達而參與胃癌MDR;而Ezrin蛋白與GST-π表達之間并未發現明顯相關，說明在導致胃癌MDR的多種機制中，Ezrin蛋白可能僅與其中部分機制有關。這些結果僅處于現象觀察階段，具體機制尚待進一步研究予以闡明。

本研究初步證實了Ezrin蛋白在胃癌組織中表達增高，它可能通過影響P-gp、LRP的表達而參與胃癌MDR。但我們也發現Ezrin蛋白僅與部分胃癌MDR蛋白有關，關于Ezrin蛋白參與胃癌MDR的機制還不明確，有待于進一步深入研究。

1 Wang CH，Zheng WB，Qiang O，et al.Effects of non-cytotoxic drugs on the growth of multidrug-resistance human gastric carcinoma cell line.J Dig Dis，2009，10:91-98.

2 Tan J，Zhang C，Qian J.Expression and significance of Six1 and Ezrin in cervical cancer tissue.Tumour Biol，2011，32:1241-1247.

3 Zhao J，Zhang X，Xin Y.Up-regulated expression of Ezrin and c-Met proteins are related to the metastasis and prognosis of gastric carcinomas.Histol Histopathol，2011，26:1111-1120.

4 Bernaba BN，Vogiatzis PI，Binder SW，et al.Potentially useful markers for desmoplastic melanoma:an analysis of KBA.62，p-AKT，and ezrin.Am J Dermatopathol，2011，33:333-337.

5 He ZY，Wen H，Shi CB，et al.Up-regulation of hnRNP A1，Ezrin，tubulin β-2C and Annexin A1 in sentinel lymph nodes of colorectal cancer.World J Gastroenterol，2010，16:4670-4676.

6 Schrickx JA，Fink-Gremmels J.A porcine lymphocyte model for P-gp inhibition studies.J Vet Pharmacol Ther，2011，34:499-501.

7 Thévenin AF，Zony CL，Bahnson BJ，et al.GST pi modulates JNK activity through a direct interaction with JNK substrate，ATF2.Protein Sci，2011，20:834-848.

8 Wang J，Zhang J，Zhang L，et al.Expression of P-gp，MRP，LRP，GST-π and TopoIIα and intrinsic resistance in human lung cancer cell lines.Oncol Rep，2011，26:1081-1089.