產漆酶培養基條件的優化

趙玉萍 陳曉旺

（淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇 淮安 223003）

農作物秸稈、稻殼和森林廢棄物在內的木質纖維素類物質是世界上最廣泛的可再生資源，是最具前景的生物轉化生產原料。天然的纖維素物質除了本身更加致密的晶體結構外，一般還含有半纖維素和木質素等，這些物質“包裹”在纖維素外側，形成了纖維素的天然屏障［1］，因此利用木質纖維素在技術上和成本上具有較大的挑戰。當前水解木質纖維素主要有3條途徑：酸解法、酶解法和微生物降解法［2］。酸解法因對環境污染大而較少應用，酶解法和生物水解法因其處理過程溫和、能耗低、設備要求低而備受關注［3］。據報道［4－7］，降解木質素的微生物有白腐真菌、褐腐真菌和軟腐真菌，其中白腐真菌以其酶活高、酶系完全成為研究的熱點。木質素的降解主要依賴3種酶，即漆酶（Lac）、錳過氧化物酶（MnP）和木質素過氧化物酶（LiP），其中漆酶是一種結合多個銅離子的多酚氧化酶，能催化各種芳烴類化合物（特別是酚類）的氧化［8］。由白腐真菌產生的漆酶因其來源廣泛、催化活性強而具有廣泛應用前景和價值，但因酶活不高，一直以來是研究的熱點［9］。

本試驗利用實驗室保藏白腐真菌，采用響面法優化產漆酶培養基提高酶活，為漆酶的進一步研究及工業化生產提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：白腐真菌，本實驗室保藏。

超凈工作臺：BCM－1000，上海和呈儀器制造有限公司；

恒溫搖床：QYC－211，上海福瑪實驗設備有限公司。

1.2 培養基及配制方法

（1）斜面培養基：PDA 培養基。

（2）種子培養基：葡萄糖20g，硫酸銨3.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41.0g ，Na2HPO40.2 g，MnSO40.035g，CuSO4·5H2O 0.007g，吐溫－80 3mL，加蒸餾水至1 000mL。

（3）初始發酵產酶培養基：麩皮10g，葡萄糖10g，硫酸銨0.1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.2g，MnSO40.035g，CuSO4·5H2O 0.007g，吐 溫－80 3mL，加蒸餾水至1 000mL［10］。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養條件 種子培養基和產酶培養基裝液量均為100mL／250mL三角瓶，搖瓶中加入10顆玻璃珠。搖床條件均為28℃、150r／min。種子培養時間為24h，接種量為10%。

1.3.2 酶活測定

（1）粗酶液制備：取發酵液8 000r／min離心10min，上清液即為粗酶液。

（2）漆酶活性測定：參照文獻［11］、［12］修改如下：4mL的反應混合液中，含有3.4mL 0.1mol／L的pH 4.0的醋酸鈉緩沖液，0.5mL 3.34mmol／L 甲苯胺，0.1 mL 適當稀釋的酶液，于40℃下反應5min，測600nm 處的OD 值，1個酶活單位用每分鐘OD 值增加0.1來表示。

2 結果與討論

2.1 初始酶活

根據上述培養條件，采用起始產酶培養基發酵產酶，測定漆酶酶活，其酶活變化曲線見圖1。

圖1 起始發酵產酶培養基中漆酶酶活曲線Figure 1 Laccase activity curve of original enzyme production medium

由圖1 可知，菌株發酵至13 d 時酶活達到最高22.5U／mL。

2.2 產酶培養基的條件優化

研究不同氮源對產酶的影響，氮源濃度及其它條件均同發酵產酶培養基。分別以（NH4）2SO4、酒石酸銨、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏作為不同的氮源作產酶研究。最大酶活測定結果見圖2。

由圖2可知，發酵產酶培養基的最佳氮源為酒石酸銨，其酶活可達26.4U／mL。

圖2 不同氮源對酶活的影響Figure 2 Effect of difference nitrogen sources on Lac activity

2.3 確定主要因素

從麩皮、葡萄糖、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅、吐溫－80 這9 種因素，進行單因素試驗，初步篩選出對菌株產酶影響較大的3種因素，然后通過Design－Expert軟件進行三因素三水平的試驗，根據軟件所提供的各種條件進行試驗。

在原有發酵產酶培養基基礎上，在其它因素不變的情況下，僅對麩皮添加量進行單因素試驗，其添加量分別為5.0，7.5，10.0，12.5，15.0g／L，測定酶活。依據相同的方法作其它單因素試驗，分別改變葡萄糖、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅和吐溫－80的添加量，結果見圖3～5。

圖3 不同質量麩皮、葡萄糖和酒石酸銨對Lac酶活的影響Figure 3 Effects of difference concentrations of wheat bran，glucose and ammonium tartrate on Lac activity

圖4 不同質量磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和硫酸鎂對Lac酶活的影響Figure 4 Effects of difference concentrations of KH2PO4，Na2HPO4and MgSO4on Lac activity

由圖3～5可知，麩皮、酒石酸銨、吐溫－80 3種物質對酶活影響較大，其它因素影響不明顯，確定麩皮、酒石酸銨和吐溫－80為主要影響因素。

2.4 顯著影響因子的Box－Behnken設計試驗優化

根據Box－Benhnken的中心組合試驗設計原理，進行三因素三水平的響應面分析試驗。試驗設計因子水平見表1，試驗設計矩陣和結果見表2。

2.5 漆酶的響應面結果與分析

利用Design－Expert軟件對表中試驗數據的二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，以發酵液漆酶酶活為響應值Y，其結果見表3。

圖5 不同質量硫酸錳、硫酸銅和吐溫－80對Lac酶活的影響Figure 5 Effects of difference concentrations of MnSO4，CuSO4and Tween－80on Lac activity

表1 Box－Behnken試驗設計因子水平表Table 1 Levels of the variables in the Box－Behnken experimental design

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性由F 檢驗來判定，P值越小，則相應變量的顯著程度越高。由表3可知，一次項系數X1、X2、X3，二次項系數X21、X22、X23，交互項系數X1X3的P 值均小于0.05，說明這些因素對菌株發酵產漆酶酶活影響顯著。而交互項X1X2、X2X3的P 值均大于0.05，說明X1與X2、X2與X3之間的相互作用小，對發酵生產漆酶酶活影響不顯著。經過對試驗數據的回歸分析，得到二次多元回歸方程：

表2 響應面法設計矩陣和結果Table 2 Design matrix and results of response surface methodology

表3 漆酶的方差及顯著性分析結果Table 3 Variance and significance analysis of Lac activity

由表3可知，復相關系數R2＝96.74%，說明響應值的變化有96.74%來源于所選變量。因此該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程對本試驗產木質素酶降解菌株發酵產酶進行分析和預測。

根據響應面回歸方程利用Design－Expert軟件繪制的響應曲面圖和等高線圖，見圖6～8。

圖6 麩皮和酒石酸銨對漆酶表達的響應面與等高線圖Figure 6 Response surface and corresponding contour plot（wheat bran，ammonium tartrate）

每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用。由圖6～8可知，麩皮、酒石酸銨和吐溫－80與漆酶產量存在顯著的相關性。當酒石酸銨和吐溫－80維持固定在最佳水平時，麩皮的添加量由7.50g／L 升至11.04g／L 時，漆酶產量隨之升高，當超過11.04g／L時，漆酶產量開始下降。同時，由相應的等高線圖可以看出，麩皮和酒石酸銨、吐溫－80和酒石酸銨、麩皮和吐溫－80 的等高線均呈橢圓形，交互作用顯著。

2.6 菌株發酵最佳條件的確定及檢驗

為確定本試驗產纖維素酶菌株最佳的發酵條件，根據Design－Expert軟件分析和預測，獲得漆酶酶活最大值時，主要因素麩皮、酒石酸銨和吐溫－80 的優化值分別為11.04，0.10g／L和3.24mL／L。根據模型的預測，菌株在優化后的條件下發酵產生Lac酶酶活最大值為34.25U／mL。

圖7 吐溫－80和酒石酸銨對漆酶表達的響應面與等高線圖Figure 7 Response surface and corresponding contour plot（Tween－80，ammonium tartrate）

圖8 麩皮和吐溫－80對漆酶表達的響應面與等高線圖Figure 8 Response surface and corresponding contour plot（Tween－80，wheat bran）

為檢驗模型預測值與實際試驗值之間的相關性，即檢驗響應面優化模型的可靠性，對菌株在預測的最優條件下發酵產酶能力進行實驗驗證，測得其發酵后的Lac 酶酶活為36.67U／mL，與預測值十分接近。優化后酶活與比優化前提高了62.98%。

3 結論

本試驗采用白腐真菌發酵生產漆酶，利用Design－Expert軟件在單因素試驗的基礎上，通過響應面分析影響漆酶酶活的主要因素為麩皮、酒石酸銨和吐溫－80，研究了在最優條件下，Lac酶的最大酶活可達36.67 U／mL，比優化前提高了62.98%，證明該方法提高漆酶酶活切實可行。

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