固定化菠蘿果酒酵母菌的制備及其應用

王 玲 尚云青 匡 鈺 王阿敏

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.云南中醫學院，云南 昆明 650500）

細胞固定化的方法目前有吸附法、交聯法和包埋法［1］。吸附法是利用載體和細胞表面所帶電荷的靜電引力，使細胞吸附于載體上，該法條件溫和、方法簡便、載體可再生，但操作穩定性差；交聯法是利用雙功能或多功能試劑與細胞表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）反應，從而使細胞固定，此法可得到較高的細胞濃度，但機械強度低，無法再生，實際生產應用不多；包埋法是在無菌條件下，將生物細胞和凝膠溶液混合在一起，然后再經過相應的處理，形成直徑為1～4mm 的膠粒，此法制得的固定化細胞和載體間沒有束縛，固定化后，細胞仍保持較高活力。目前生產上常采用的是包埋法。

海藻酸鹽是一種廣泛應用的固定化介質，具有化學穩定性好、無毒、包埋效率高且價格低廉等優點［2］。本試驗以海藻酸鈉為載體，以絲瓜瓤為支持物制備固定化菠蘿果酒酵母菌，通過單因素試驗和正交試驗，對酵母菌的固定化條件進行研究；并將制備好的菠蘿果酒固定化酵母菌應用于菠蘿果酒發酵過程中，比較固定化酵母與游離酵母的酒精發酵能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

菠蘿：購于湛江農貿市場；

酵母菌：菠蘿果酒酵母菌，本實驗室自行分離；

YPD 液體培養基（酵母浸出粉胨葡萄糖培養基，用于酵母菌的繁殖）：蛋白胨2%，酵母浸膏1%，葡萄糖2%（制備YPD 固體培養基時再加2%的瓊脂）；

植物載體絲瓜瓤：本實驗室自制。

1.1.2 試劑

海藻酸鈉、氯化鈣、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸（濃度36%）、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器和設備

電熱恒溫培養箱：HPX－9162MBE 型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

滅菌鍋：YXQ－SG46－280S型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

雙面垂直超凈工作臺：SW－CJ－2型，上海綠宇生物科技有限公司；

離心機：3－18K 型，德國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

（1）酵母菌的活化及擴大培養：在無菌條件下，接種一環酵母菌于YPD 斜面培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱中活化培養48h。取出后在無菌條件下接種兩環活化好的酵母菌于已滅菌的YPD 液體培養基中，放入30 ℃恒溫培養箱中搖床培養10h［3］。

（2）濕菌體的制備：在無菌條件下取適量擴大培養的酵母菌菌懸液，于8 000r／min離心10min，傾去上清液，用無菌生理鹽水洗滌菌體，離心后稱重，制得濕菌體。

（3）酵母細胞濃度的測定：采用梯度稀釋平板計數法計算細胞濃度。無菌操作條件下，對酵母菌進行10倍遞減稀釋至適當濃度。取1mL 在YPD 瓊脂培養基上涂布后置于30 ℃±1 ℃恒溫培養箱中培養48h后，用菌落計數器進行菌落計數，換算擴大培養后培養液中的酵母細胞濃度。

（4）無菌絲瓜瓤薄片的制備：取老熟的絲瓜剝去外皮，除去內瓤，剪切成多個長為2.5cm、寬度為2～3cm、厚度2～3mm 的薄片，然后將其放進沸水中沸煮30min后取出，用蒸餾水沖洗，然后把沖洗干凈的瓜片放入無菌水中浸泡24h，取出放入恒溫為70 ℃的烘箱中烤烘5～6h，至恒重，制得絲瓜瓤［4］。將制好的絲瓜瓤存放在干燥器中待用。

（5）固定化酵母菌的制備：以不同的填充量向不同濃度的海藻酸鈉溶液中加入酵母濕菌體，混合均勻后放入已滅菌的絲瓜瓤薄片，待混合液充分浸入到絲瓜瓤的縫隙，用無菌鑷子將浸滿混合液的絲瓜瓤移入到不同濃度的已滅菌的氯化鈣溶液中，交聯約2h，將形成的固定化酵母移入無菌蒸餾水中洗滌兩次，備用［5］。

1.2.3 酵母菌固定化工藝的優化

（1）海藻酸鈉溶液濃度對固定化酵母菌機械強度的影響：按7%填充量將酵母濕菌體分別與濃度為1%，2%，3%，4%，5%的無菌海藻酸鈉溶液進行混合，同時放入無菌絲瓜瓤，混合均勻后將浸滿混合含菌液的絲瓜瓤放入濃度為2%、pH 值為6.0的無菌氯化鈣溶液中交聯2h。通過測定固定化酵母菌機械強度，研究海藻酸鈉溶液濃度對固定化酵母菌機械強度的影響。

（2）氯化鈣溶液濃度對固定化酵母菌機械強度的影響：按7%填充量將酵母濕菌體與1.2.3（1）所獲得的最佳海藻酸鈉溶液濃度進行混合，同時放入無菌絲瓜瓤，混合均勻后將浸滿混合含菌液的絲瓜瓤放入濃度分別為1%，2%，3%，4%，5%，pH 值為6.0的無菌氯化鈣溶液中交聯2h。通過測定固定化酵母菌的機械強度，研究氯化鈣溶液濃度對固定化酵母菌機械強度的影響。

（3）氯化鈣溶液酸堿度對固定化酵母菌機械強度的影響：按7%填充量將酵母濕菌體與1.2.3（1）所獲得的最佳海藻酸鈉溶液濃度溶液進行混合，同時放入無菌絲瓜瓤，混合均勻后將浸滿混合液的絲瓜瓤放在1.2.3（2）所獲得的最佳無菌氯化鈣、pH 分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的溶液中交聯2h。通過測定固定化酵母菌的機械強度，研究氯化鈣溶液的酸堿度對固定化酵母菌機械強度的影響。

（4）影響固定化酵母菌機械強度的正交試驗設計：根據單因素試驗結果，以海藻酸鈉溶液濃度、氯化鈣溶液濃度、氯化鈣溶液酸堿度為因素，設計L9（34）的正交試驗，對固定化酵母菌的制備進行工藝優化。

1.2.4 固定化酵母菌酒精發酵工藝的優化

（1）接種量對酒精發酵的影響：分別按6%，8%，10%，12%，14%的接種量將酵母菌進行固定化。將固定化酵母菌置于初始糖度為20%、pH 值為4.5 的滅菌菠蘿汁中，于32 ℃恒溫搖床發酵7d，以發酵結束時酒精度為指標確定最佳接種量。

（2）初始糖度對酒精發酵的影響：分別調節初始糖度為12%，15%，18%，21%，24%，滅菌后按1.2.4（1）所獲得的最佳接種量加入固定化酵母菌，置于30 ℃恒溫培養箱中搖床發酵7d，以發酵結束時酒精度為指標確定最佳初始糖度。

（3）溫度對酒精發酵的影響：分別設置發酵液溫度為24，28，32，34，36，40 ℃，分別按1.2.4（1）和（2）所獲得的最佳接種量和最佳初始糖度恒溫搖床發酵7d，以發酵結束時酒精度為指標確定最佳溫度。

（4）菠蘿果汁pH 對酒精發酵的影響：調節pH 分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，滅菌后加入固定化酵母菌，分別按1.2.4（1）、（2）和（3）所獲得的最佳接種量、初始糖度和溫度，恒溫搖床發酵7d，每天測定酒精度。以酒精度為指標確定最佳pH 值。

1.2.5 重復利用和細胞泄漏試驗 固定化酵母菌的重復利用試驗是將固定化酵母在無菌發酵菠蘿汁中第一次發酵結束后，傾濾出發酵液，將固定化酵母用無菌蒸餾水洗滌3次除去雜質后，再放入與第一次發酵試驗成分相同的無菌發酵培養基，繼續進行第2次發酵，同樣的方法再進行酵母菌的洗滌和第3～6次重復發酵試驗。分別吸取第1～6次發酵結束后的發酵液1 mL，采用梯度稀釋平板計數法測定酵母菌濃度，計算每次重復發酵結束后泄漏于發酵液中的酵母菌濃度考察固定化酵母的重復使用次數。

1.2.6 發酵性能比較試驗 按9%的接種量稱取兩份質量相同的酵母菌濕菌體，1份進行固定化，用于固定化發酵，另1份用于游離酵母細胞發酵。無菌操作下將兩份酵母菌分別移入200mL初始糖度18%、pH 4.8 的滅菌菠蘿果汁中，置于32 ℃恒溫培養箱中搖床發酵7d，每天測定酒精度。以最終形成的酒精度比較固定化酵母與游離酵母的發酵能力。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 酒精度的測定 蒸餾法，按GB／T 15038——2006執行。

1.3.2 酵母細胞濃度的測定 按GB／T 4789.2——2010執行。

1.3.3 固定化酵母菌機械強度的測定 按壓法，以固定化酵母菌的正面所能承受的最大壓力來表征機械強度。隨機取固定化酵母菌置于玻璃片上，上面蓋上質量可以忽略的薄玻片。輕輕在薄玻片上加一個100g的砝碼，計時60s，用0～150mm 游標卡尺分別測量施壓前后的高度。然后按式（1）計算固定化酵母菌機械強度［6］：

式中：

P—— 固定化酵母菌機械強度，g／mm2；

h0—— 施壓前高度，mm；

h1—— 施壓后高度，mm。

2 結果與分析

2.1 單因素對固定化體系的機械強度的影響

2.1.1 海藻酸鈉溶液濃度的影響 海藻酸鈉濃度對機械強度的影響見圖1。由圖1可知，在海藻酸鈉溶液濃度為3%以下，固定化酵母的機械強度隨著海藻酸鈉溶液濃度的升高而逐漸升高，在當海藻酸鈉溶液濃度為3%后，固定化體系的機械強度逐漸降低。

圖1 海藻酸鈉濃度對機械強度的影響Figure 1 Effect of the mass fraction of sodium alginate on gel strength

2.1.2 氯化鈣溶液濃度的影響 在海藻酸鈉做包埋劑固定化酵母細胞過程中，固定劑氯化鈣中的鈣離子與海藻酸根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細胞固定［7］。氯化鈣溶液濃度對機械強度的影響見圖2。

圖2 氯化鈣濃度對機械強度的影響Figure 2 Effect of the mass fraction of calcium chloride on gel strength

由圖2可知，在氯化鈣溶液濃度為3%以下，固定化酵母的機械強度隨著氯化鈣溶液濃度的升高而逐漸升高，在當氯化鈣溶液濃度達到3%后，固定化體系的機械強度逐漸降低。

2.1.3 氯化鈣溶液酸堿度的影響 固定化的過程中是利用海藻酸鹽的pH 值降到6.0 左右時，鈣鹽釋放出鈣子，從而形成凝膠［8］。氯化鈣酸堿度對機械強度的影響見圖3。

圖3 氯化鈣酸堿度對機械強度的影響Figure 3 Effect of pH value of calcium chloride on gel strength

由圖3可知，在氯化鈣溶液pH 為6.0以內，固定化酵母的機械強度隨著氯化鈣溶液pH 的升高而逐漸升高，在當氯化鈣溶液pH 為6.0后，固定化體系的機械強度逐漸降低。

2.2 影響固定化酵母菌機械強度的正交試驗

以單因素試驗結果所獲得的較理想海藻酸鈉溶液濃度、氯化鈣溶液濃度、氯化鈣溶液酸堿度為因素，設計L9（34）的正交試驗。正交試驗因素水平表見表1，以固定化酵母菌機械強度為考核指標，試驗結果見表2。

由表2可知，因素A 為影響機械強度的最重要因素，然后依次是因素B 和C；最優組合為A2B2C3，恰為5 號處理組，即海藻酸鈉溶液濃度為3%、氯化鈣溶液濃度為3%、氯化鈣溶液的pH 值為6.5，在此條件下制得的固定化酵母菌的機械強度最大。

表1 影響固定化酵母菌機械強度試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of immobilized by embedding linking method

表2 影響固定化酵母菌機械強度的正交試驗結果與分析Table 2 Orthogonal experiment results and analysis of immobilized by embedding linking method

2.3 固定化酵母菌酒精發酵的影響試驗

2.3.1 接種量對酒精發酵的影響 接種量的大小決定了生產菌種在發酵液中生長繁殖的速度、發酵速度以及最終的發酵酒精度。較大的接種量可以縮短時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長；但接種量過大或者過小，均會影響發酵速度及最終的發酵酒精度［9］。由圖4可知，在接種量為10%以內，固定化酵母菌發酵產生的酒精度隨著接種量的升高而升高，在接種量為10%后，酒精的生成量逐漸降低。因此，最佳接種量為10%。

2.3.2 初始糖度對酒精發酵的影響 發酵液初始糖度對酵母的生長繁殖、發酵速度與發酵周期、雜菌污染等影響較大。初始糖度高，發酵速度快，但糖度過高，發酵液會產生較高的滲透壓，細胞在這種環境中活性會降低。由圖5可知，在初始糖度為18%以下，固定化酵母菌發酵產生的酒精度隨著接種量的升高而升高，在初始糖度為18%后，酒精的生成量逐漸降低。因此，最佳初始糖度為18%。

圖4 接種量對發酵酒精度的影響Figure 4 Changes of alcohol on different cell filling amount

圖5 初始糖度對發酵酒精度的影響Figure 5 Effect of initial of glucose concentration on producing alcohol of fermentation

2.3.3 溫度對酒精發酵的影響 發酵溫度對酵母菌的生長繁殖、發酵速度與周期、雜菌污染等影響較大。適當提高溫度，固然可以加快發酵速度，提高發酵速率，但過快的發酵速度會在短時間內消耗完基質中的養分，導致發酵后勁不足，發酵液酸敗［10］。由圖6可知，溫度為32 ℃時酵母菌的酒精產量比其它溫度條件下的酒精產量高，說明32 ℃是固定化酵母菌發酵的理想溫度。

2.3.4 發酵液pH 對酒精發酵的影響 發酵液pH 的選擇應同時考慮酵母發育和發酵液發酵的最適環境。發酵液pH過高或過低，都會影響發酵培養基中營養物質的離子化程度，從而影響基質中營養物質的可給性或產生異常代謝物質。由圖7可知，在發酵液pH 為4.5以內，固定化酵母菌發酵產生的酒精度隨著pH 的升高而升高，在pH 達到4.5后，發酵液酒精的生成量逐漸降低。因此，最佳pH 為4.5。

圖6 溫度對發酵酒精度的影響Figure 6 Effect of fermentation temperature on alcohol production

圖7 菠蘿果汁pH 值對發酵酒精度的影響Figure 7 Effect of different pH value on fermentation

2.4 重復利用和細胞泄漏試驗

隨著重復使用次數的增加，菌株的不斷生長會造成固定化酵母菌的機械強度不斷下降，從而發生細胞泄漏，最終使固定化酵母細胞的發酵性能有所下降。由表3可知，固定化酵母菌重復利用3次時，發酵液中的游離細胞數還比較少，但重復利用4次后，發酵液中酵母細胞數明顯增加，說明此時固定化酵母菌機械強度下降，固定化酵母細胞失去束縛力而被泄漏出來，固定化體系穩定性下降，重復第5次時，由于固定化體系中的固定化酵母菌的泄漏使固定化體系中酵母菌含量減少，因而泄漏于發酵液中的酵母菌比重復利用第4次后發酵液中的游離酵母細胞要少，重復利用第6次后，幾乎沒有發現酵母細胞泄漏于發酵液中，此時的固定化酵母菌也幾乎失去了發酵能力。因此，固定化酵母菌的重復使用次數在4次以內為佳。

表3 重復利用和細胞泄漏試驗Table 3 Repeated usability and cells leak quantity of immobilized cells ／（Piece·mL－1）

2.5 發酵能力比較試驗

傳統的酵母菌在發酵時是利用游離酵母進行發酵，酵母細胞直接與發酵液接觸，因此酵母細胞易受外界環境不利因素的影響而使發酵性能不太穩定；而利用固定化酵母菌發酵果酒則可以在一定程度上避免細胞與外界環境直接接觸，從而保持細胞活性。本試驗通過比較相同發酵條件下的發酵酒精度，研究游離酵母細胞與固定化酵母細胞的發酵性能，結果見圖8。由圖8可知，在相同的發酵條件下，固定化酵母細胞發酵菠蘿果汁的酒精產率比游離酵母細胞發酵菠蘿果汁的酒精產率要高，固定化細胞發酵速度較游離細胞快，生產周期較游離酵母細胞短。

3 結論

圖8 固定化酵母細胞與游離酵母細胞的發酵能力比較試驗Figure 8 The immobilized yeast cells with free yeast cells in the fermentation capacity comparative test

（1）本試驗采用海藻酸鈉為載體，以絲瓜瓤為支持物固定菠蘿果酒酵母菌。通過單因素試驗和正交試驗，以固定化酵母菌機械強度為考核指標，對酵母菌的固定化條件進行研究。結果表明：在海藻酸鈉溶液的濃度為3%、氯化鈣溶液的濃度為3%、氯化鈣溶液的pH 為6.5的條件下制得的固定化酵母的機械強度最好，是酵母菌的固定化最佳條件。

（2）將制備得的菠蘿果酒固定化酵母菌應用于菠蘿果酒發酵過程中，對影響固定化酵母菌酒精發酵的單因素進行研究。結果表明：在發酵溫度為32 ℃、初始糖度18%、pH 4.5、酵母菌接種量為10%的條件下，菠蘿果酒固定化酵母發酵速度最快，酒精產量最高；重復使用次數以4次之內為佳；在同種發酵條件下，固定化酵母發酵酒精產率優于游離狀態下的菠蘿果酒酵母細胞。

（3）固定化酵母具有使用方便、細胞活力強、發酵效率高、載體可再生等優點，是實現規模化、機械化生產果酒的一個重要保障。

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