響應面法優化葡萄籽多酚提取工藝

唐華麗 熊漢國 王 瑋

（1.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶 萬州 404000；2.華中農業大學食品科技學院，湖北 武漢 430070）

葡萄籽為落葉藤本植物葡萄的種子，是葡萄酒廠和果汁廠的主要副產品，因其富含多酚類物質、各種氨基酸等營養成分而具有重要的利用價值［1－3］。研究［4－6］表明，葡萄籽多酚作為葡萄籽提取物的主要成分具有很好的清除自由基、預防動脈粥樣硬化、輔助抗腫瘤、美容等生理功能。國內外對葡萄籽多酚的提取工藝進行了廣泛研究，但大部分研究存在工藝復雜［7，8］，耗時較長，得率較低［9］等不足。探索葡萄籽多酚類物質經濟有效的提取工藝有利于提升葡萄籽廢渣的附加值，具有極大的社會經濟價值。本試驗以葡萄籽為研究對象，采用有機溶劑法提取其中的多酚類物質，以多酚提取量為指標，采 用Design－Expert軟 件 的Central Composite Design法設計響應面試驗，優化葡萄籽多酚的提取工藝條件，以有效提高葡萄籽資源的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽：萬州花鳥市場；

無水碳酸鈉、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙醇、沒食子酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、無水硫酸鋰、溴水等：分析純，重慶醫藥公司。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計：UV－2450，日本島津公司；

分析天平：ML203，北京賽多利斯公司；

恒溫水浴鍋：HH－4，常州普天儀器制造有限公司；

離心機：TD5A－WSI，濟南福的機械有限公司；

小型組織粉碎機：JJ－2，萬州江東機械廠；

旋轉蒸發儀：RE－52A，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄籽多酚提取工藝

1.3.2 多酚含量的測定 采用酒石酸亞鐵比色法［10，11］。以沒食子酸為標準品，配制成一定濃度后測定繪制標準曲線，得標準曲線回歸方程：y＝0.586x－0.001 5，R2＝0.996 3。依標準曲線方程求出提取液中多酚質量濃度（mg／mL）。

1.3.3 提取試劑的選擇 取0.500g葡萄籽粉，分別用10倍體積（V／m）70%體積分數的甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮溶液按照1.3.1工藝流程浸提，比較4種有機溶劑對多酚的浸提效果。

1.3.4 提取工藝單因素試驗

（1）在提取溫度70 ℃、提取時間20min、提取次數3次的條件下，分別考查不同體積分數（10%，30%，50%，70%，90%）的提取溶劑對葡萄籽多酚提取量的影響；

（2）在提取溶劑體積分數70%、提取溫度70 ℃、提取次數3 次的條件下，分別考查 不同提 取時間（5，10，20，30，40min）對葡萄籽多酚提取量的影響；

（3）在提取溶劑體積分數70%、提取時間20min、提取次數3次的條件下，分別考查不同提取溫度（40，50，60，70，80 ℃）對葡萄籽多酚提取量的影響；

（4）在提取溶劑體積分數70%、提取溫度70 ℃、提取時間20min的條件下，分別考查不同提取次數（1，2，3，4，5次）對葡萄籽多酚提取量的影響。

1.3.5 葡萄籽多酚提取響應面法優化分析 本試驗采用Design－Expert 8.05b軟件的中心組合試驗設計原理設計響應面試驗。

2 結果與分析

2.1 提取試劑的確定

由圖1可知，4種有機溶劑中，以丙酮為提取試劑的浸提效果最好，提取多酚含量可達2.468mg／mL，乙酸乙酯次之，甲醇最差。故本試驗選用丙酮作為葡萄籽多酚的提取試劑。

2.2 葡萄籽多酚提取響應面法優化分析

在單因素試驗的基礎上，確定了各因素合適的條件范圍，根據Central Composite Design中心組合試驗設計原理，設計四因素三水平的響應面分析試驗。試驗因素水平見表1，設計及結果見表2。

圖1 提取溶劑類型對葡萄籽多酚提取量的影響Figure 1 Effects of extraction solvent type on grape seeds polyphenols yield

表1 試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

根據響應面分析法試驗結果，對試驗數據進行多元回歸擬合分析，得到葡萄籽多酚提取量與各因素變量的二次方程模型：

表3給出了由響應面分析法對上述數學模型和正交試驗結果進行的方差分析結果。由方差分析結果可以看出，該模型P值小于0.01，表明二次方程模型極顯著。而失擬項P值大于0.10不顯著，表明該模型對試驗的擬合情況良好，誤差較小，可以通過該模型預測試驗結果。各因素對葡萄籽多酚提取量的影響由大到小依次為丙酮體積分數（A）、提取溫度（C）、提取次數（D）、提取時間（B）。因素間交互作用的響應面圖見圖2、3。

表3 葡萄籽多酚提取量的方差分析結果Table 3 Results of regression analysis of grape seeds polyphenols yield

圖2 丙酮體積分數與提取時間交互作用對葡萄籽多酚提取量的響應面圖Figure 2 Response surface plots showing the effect of acetone concentration and extraction duration

圖3 提取時間與提取溫度交互作用對葡萄籽多酚提取量的響應面圖Figure 3 Response surface plots showing the effect of extraction duration and extraction temperature

由圖2和圖3可知，丙酮體積分數與提取時間（A）、提取時間和提取溫度（B）之間的交互作用對葡萄籽多酚提取量有顯著影響。

根據響應面分析所建立的數學模型，以及軟件分析得出響應值較大的提取條件（表4試驗1～5），將其與響應面試驗（表2）中提取量最高的試驗條件（表4 試驗6）進行驗證實驗，以尋找葡萄籽多酚提取的最佳工藝條件，結果見表4。

表4 驗證實驗結果Table 4 Results of verification experiments

由表4可知，當丙酮體積分數為72%、提取時間32min、提取溫度65 ℃、提取次數4次時，葡萄籽多酚提取量達到最大值。

3 結論

（1）本試驗采用溶劑法對葡萄籽中多酚類物質進行提取，對比了4種不同有機溶劑對葡萄籽多酚類物質的提取效果，結果表明丙酮提取葡萄籽多酚工藝簡單、提取時間短、提取率較高。

（2）利用Design－Expert軟件設計響應面試驗，優化葡萄籽多酚提取工藝條件，并進行驗證實驗。試驗表明葡萄籽多酚的最佳提取工藝條件為丙酮體積分數 72%，提取時間32 min，提取溫度65 ℃，提取次數4次，在此條件下多酚提取量可達2.892mg／mL。

（3）進一步提高葡萄籽多酚的提取率還需從釋放與纖維素、蛋白質結合的結合態多酚著手。

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