楊梅果醋體外抗氧化活性的研究

謝思蕓 鐘瑞敏， 肖仔君 鄧澤元

（1.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330047；2.韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東 韶關 512005）

楊梅（Myrica rubra Bied.Et Zucc.）是原產于中國的亞熱帶水果之一，富含花色苷、黃酮等多酚類物質。多酚類物質存在于多種水果蔬菜中，具有良好的抗氧化［1，2］、抗菌［3］、抗突變［4－6］等作用。近年來，國內外學者對楊梅果實及其枝葉等的有效成分進行了較深入的研究［7－9］，先后分離鑒定了矢車菊－3－葡萄糖苷、楊梅素、槲皮素、沒食子酸等活性成分，并指出其抗氧化能力與這些活性成分的濃度呈正相關。

果醋是利用水果及水果下腳料通過微生物發酵得到的一類新型飲品，多項研究［10－12］指出，因果醋發酵條件比較溫和，能夠有效保留果品中的營養成分和多酚類活性物質，同時，微生物在發酵過程中產生了多種活性物質，如琥珀酸等有機酸，這些物質都具有一定的抗氧化能力。

楊梅果醋是楊梅果汁經酒精發酵和醋酸發酵后所得的酸性飲品。目前，對楊梅果醋的研究主要集中在發酵工藝、飲品調配和相關營養成分檢測等方面［13－15］。對其抗氧化能力的評價則較少涉及。本試驗主要探討不同釀造工藝及原料對體外抗氧化能力的影響，為以后楊梅果醋功能飲品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

楊梅果汁：廣東始興縣野生青蒂品種，始興綠而健食品有限公司；

楊梅果酒、楊梅果醋和蘋果醋：本實驗室自制；

酵母菌：安琪酵母公司；

惡臭醋酸桿菌（AS1.41）：廣東省菌種保藏中心；

高粱醋：2年陳釀產品，山西水塔醋業有限公司；

1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；

三氯乙酸、水楊酸鈉：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

三氯化鐵、鐵氰化鉀：分析純，天津市福晨化學試劑廠；

過氧化氫：分析純，天津市百世化工有限公司；

硫酸亞鐵：分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 主要儀器設備

臺式離心機：TGL－16C，上海安亭科學儀器廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH－S，6S，江蘇大地自動化儀器廠；

可見分光光度計：722N，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅果酒釀造工藝

楊梅果汁→酶解→調節糖度→巴氏滅菌→降溫接種（0.2%酵母菌，30 ℃）→攪拌發酵（24h）→靜置發酵至酒精度達6% （V／V）

1.3.2 楊梅果醋釀造工藝

楊梅果酒→巴氏滅菌→快速降溫→分別接種于10L 和50L含靈芝粒載體發酵罐（2%醋酸菌，30 ℃）→通氧攪拌恒溫發酵→以酸度不再變化為發酵終點→將醋液混合，調節酸度為4%

1.3.3 蘋果醋釀造工藝

（1）蘋果酒：清洗→打漿→酶解→過濾→蘋果汁。按楊梅果酒方法發酵成蘋果酒。

（2）蘋果醋：蘋果果酒→巴氏滅菌→快速降溫→分別接種于10L和50L 發酵罐（2%醋酸菌，30 ℃）→通氧攪拌恒溫發酵→以酸度不再變化為發酵終點→將醋液混合，調節酸度為4%。

1.3.4 樣品預處理 經上述方法所得的樣品，再經300目濾布過濾、離心后，上清液為試驗樣液，假定質量分數100%為未稀釋樣液，試驗時用蒸餾水稀釋到所需質量分數。

1.3.5 抗氧化活性的測定方法

（1）羥自由基（·OH）清除率：本體系利用Fenton反應產生羥基自由基，即H2O2與Fe2＋混合后產生·OH，當體系存在水楊酸，能有效俘獲·OH 并生成紅色產物，此物質在510nm 處有最大吸收。根據文獻［16～18］，修改如下：依次向試管中加入0.5mL FeSO4溶液（0.15mol／L）、2mL水楊酸鈉溶液（2mmol／L）、2.5mL 蒸餾水和1 mL 不 同質量分 數（6%，10%，14%，20%，30%，40%，50%，60%）的 樣 液，最后加入1 mL H2O2（6 mmol／L）啟 動 反 應，37 ℃下 反 應1h，離心取上清液，510nm 處測吸光度。按式（1）計算·OH清除率：

式中：

E—— 羥自由基清除率，%

A0—— 空白對照液的吸光度；

Ai—— 加入樣品后的吸光度；

Aj—— 樣品溶液的本底吸光度。

（2）DPPH 自由基清除率：根據文獻［19］、［20］，修改如下：準確移取5mL DPPH 溶液（6.0×10－5mol／L），加入0.6 mL不 同 質 量 分 數（5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%）的樣液，混勻，黑暗中放置30min后，離心取上清液，517nm 處測吸光度。按式（2）計算DPPH 自由基的清除率：

式中：

E——DPPH 自由基清除率，%；

A0—— 蒸餾水加DPPH 溶液的吸光度；

Ai—— 樣液加DPPH 溶液的吸光度；

Aj—— 樣液加乙醇溶劑的吸光度。

（3）還原能力：參照文獻［21］，取1 mL 不同質量分數（5%，10%，15%，20%，25%）的樣液，依次加入0.2mL PBS緩沖液（0.2mol／L，pH 6.6）和0.5mL K3Fe（CN）6（1%），混勻，50 ℃下水浴20min，取出，流水冷卻，再加入1mL 三氯乙酸（10%）終止反應，3 000r／min下離心10min，取1.5mL上清液，加入0.2mL FeCl3（1%）和3.0mL蒸餾水，搖勻，靜置5min，于700nm 處測定吸光值。

2 結果與討論

2.1 清除羥自由基（·OH）能力

2.1.1 楊梅果汁、果酒、果醋清除羥自由基（·OH）的能力

由圖1可知，楊梅果汁、果酒及果醋對羥自由基均具有良好的清除能力，在試驗濃度范圍內，其清除能力隨濃度增加而增強。當體積分數低于14%時，楊梅果醋較楊梅果汁及果酒而言，清除能力較差，清除率約為30%。隨著試驗濃度增大至20%，楊梅果醋對羥自由基的清除率持續顯著上升，高達87.6%，而此時楊梅果汁及果酒清除率分別為92%和93.6%。隨著濃度增加，三者間的清除能力相當，當達到最大的試驗濃度（60%），楊梅果醋的清除率為96.7%，而楊梅果汁和果酒均達到98.6%。雖然在較低濃度時，楊梅果醋的清除效果僅為楊梅果汁的1／3，但當濃度上升至40%，二者清除率并無顯著差別，總體說來，楊梅果醋在經過長時間發酵后，清除能力仍有較好的保留。

2.1.2 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋清除羥自由基（·OH）的能力 由圖2可知，在相同的酸度下（6%），3種醋樣清除羥自由基的能力因原料及發酵工藝不同而有明顯差異，隨著體積分數增加，其清除能力相應增強，呈濃度效應。在體系濃度低于14% 時，以高粱醋的清除效果最佳，清除率為65.1%，蘋果醋則最差，清除率僅有15.5%，而楊梅醋清除效果居中，清除率為30%。當濃度達30%以上，楊梅醋清除效率明顯提高，與高粱醋相當，當達到最大試驗濃度時，清除率分別高達96.7%和97.1%。相比較，蘋果醋的清除能力較差，隨濃度增加，清除效果變化不大，最高為43.3%，清除能力僅為楊梅醋的一半。說明楊梅果醋對羥自由基的清除率明顯優于蘋果醋，原因可能在于多酚類成分等具備抗氧化能力的物質在二者間的含量不同，而且在果醋釀造過程中，固定化發酵的方式與游離細胞發酵的方法相比，前者能有效縮短發酵時間，有利于此類物質的保留。

圖1 楊梅果汁、果酒、果醋對羥自由基的清除作用Figure 1 Scavenging effects among bayberry juice，wine and vinegar on hydroxyl free radicals

圖2 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋對羥自由基的清除作用Figure 2 Scavenging effects among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar on hydroxyl free radicals

2.2 清除DPPH 自由基能力

2.2.1 楊梅果汁、果酒、果醋清除DPPH 自由基的能力

DPPH 自由基是一種穩定的、以氮為中心的自由基，如果受試物能將其清除，則意味著受試物具有降低烷自由基或過氧化自由基的能力，同時能打斷脂質過氧化鏈反應的作用。由圖3可知，3種樣液對DPPH 自由基都具有良好的清除作用，隨著樣液濃度增加，清除效果顯著增強。其中，楊梅汁和楊梅酒清除能力相當，二者在10%的體積分數下，清除率均超過50%，當體積分數達35%時，隨著濃度增加，兩者對DPPH 的清除能力趨于穩定，楊梅酒對DPPH 自由基清除率達100%，而楊梅汁的清除率也達85.3%。相比之下，楊梅醋的清除效果較好，圖中曲線相對平緩，隨著濃度增加，其DPPH 清除能力也逐步增強，在最大試驗濃度時清除率為80.2%，清除效果與楊梅汁相當。

2.2.2 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋清除DPPH 自由基的能力

圖3 楊梅果汁、果酒、果醋對DPPH 自由基的清除作用Figure 3 Scavenging effects among bayberry juice，wine and vinegar on DPPH·

圖4 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋對DPPH 自由基的清除作用Figure 4 Scavenging effects among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar on DPPH·

由圖4可知，3種醋樣對DPPH 自由基清除能力具有顯著的差異。在最低濃度下（5%），高粱醋的清除效果很好，清除率接近90%，而楊梅醋的清除率為18.7%，蘋果醋則小于6%。隨著濃度增加，楊梅醋的清除率明顯增強，而高粱醋和蘋果醋則變化不大。當達到最高濃度（50%），高粱醋清除率達98.7%，楊梅醋為85.3%，相比較而言，蘋果醋對DPPH自由基幾乎沒有清除作用，即使在最大濃度下，其清除率約為11%，僅為高粱醋的1／9，楊梅醋的1／8。

2.3 還原能力

2.3.1 楊梅果汁、果酒、果醋的還原能力 一般而言，當一種物質具有較強的還原能力，相應的也具有較強的抗氧化能力。根據1.3.5（3）中的方法，若樣液在700nm 處吸光值越大，則其將Fe3＋轉化Fe2＋的量及生成的普魯士藍的量越多，表明其還原能力越強，即抗氧化能力越好。由圖5可知，3種樣液都具有較好的還原能力。其中，楊梅汁的還原能力最大，楊梅酒次之，楊梅醋最低。

2.3.2 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋的還原能力 由圖6 可知，楊梅醋和高粱醋的還原能力相當。高粱醋的還原能力隨著樣液濃度增大而不斷增強，體積分數達20%時，其還原力趨于穩定，而楊梅醋則仍處于顯著上升趨勢。而蘋果醋還原能力明顯低于其它兩種醋樣。

圖5 楊梅果汁、果酒、果醋還原能力測定Figure 5 Reducing capacity among bayberry juice，wine and vinegar

圖6 楊梅果醋、蘋果醋、高粱醋還原能力測定Figure 6 Reducing capacity among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar

綜上所述，經酒精發酵和醋酸好氧發酵制備的楊梅果醋，與楊梅果汁相比雖然其抗氧化能力有所下降，但仍然具備比較理想的抗氧化活性。果醋所經歷的二次發酵會造成楊梅多酚類物質的損失，尤其是醋酸發酵過程中的持續供氧易造成抗氧活性物質的化學性氧化而損失部分抗氧化能力。由于固定化發酵時間相對較短，可減少因好氧發酵供氧造成的抗氧化物質的損失，因此固定化發酵制備的果醋抗氧化能力遠遠大于游離細胞發酵的果醋。本試驗選取的市售高粱醋對照樣品抗氧化活性最強（該產品以富含多酚類抗氧化物質的高粱、豌豆為主要原料釀造），這也說明中國北方地區生產的一些以高粱為主料的食醋擁有良好的保健價值。

3 結論

本試驗結果表明，采用固定化細胞發酵的楊梅原醋含量達30%以上配制的楊梅果醋飲料仍然表現出良好的抗氧化能力。楊梅果醋飲料中的原醋比例為35%～50%時，具有較好的酸感和風味。因此，采用楊梅果醋不僅可調配風味適宜的果醋飲料，同時還擁有良好的抗氧化活性，具有開發應用價值。

后續研究擬通過在果酒和果醋發酵過程中添加具有抗氧化能力的物質來保護原汁中的有效成分，或通過淺度發酵果酒并制備醋酸含量相對較低的楊梅果醋來縮短發酵時間以保護楊梅汁中多酚類成分，使楊梅果醋抗氧活性進一步提高。

1 Filiz Tezcan，Mine Gültekin－zgüven，Tug～ba Diken，et al.Antioxidant activity and total phenolic，organic acid and sugar content in commercial pomegranate juices［J］.Food Chemistry.2009，115（15）：873～877.

2 Kang Jie，Li Zhimin，Wu Tong，et al.Anti－oxidant capacities of avonoid compounds isolated from acai pulp（Euterpe oleracea Mart.）［J］.Food Chemistry，2010，122（19）：610～617.

3 Yang Ling－ling，Chang Chia－chen，Chen Lih－geeng，et al.Antitumor prinple constituents of Myrica rubra Var.acuminata［J］.J.Agric.Food Chem.，2003，51（10）：2 974～2 979.

4 遲文，徐靜，譚巍，等.楊梅多酚對大、小鼠血小板損傷的保護作用［J］.中國藥房，2002，13（1）：16～17.

5 遲文，徐靜，郭凌燕，等.楊梅多酚對核輻射損傷的血細胞與造血組織的保護作用［J］.解放軍藥學學報，2003，19（3）：168～170.

6 洪振豐，王鄭選，高碧珍，等.楊梅果汁的抗微核突變作用［J］.福建中醫學院學報，1998，8（3）：36～37.

7 潘向榮.楊梅抗氧化特性研究［D］.杭州：浙江大學，2002.

8 張宇環.楊梅汁中酚類物質及抗氧化性的研究［D］.杭州：浙江大學，2008.

9 陳健初，夏其樂，潘向榮，等.楊梅果汁的抗氧化特性研究［J］.浙江大學學報，2004，30（6）：657～661.

10 張鋒，金杰，劉春芬，等.果醋抗氧化作用研究進展［J］.釀酒科技，2008，（15）：8～11.

11 Ubeda C，Hidalgo C，Torija M J，et al.Evaluation of antioxidant activity and total phenols index in persimmon vinegars produced by different processes［J］.LWT－Food Science and Technology，2011，44（9）：1 591～1 594.

12 Alberto Da′valos，Begon～a Bartolome，Carmen Gómez－Cordovés，et al.Antioxidant properties of commercial grape juices and vinegars［J］.Food Chemistry，2005，93（11）：325～330.

13 朱正軍，孔國平，夏燕，等.楊梅果醋發酵工藝研究［J］.試驗報告與理論研究，2008，11（10）：28～31.

14 包啟安.食醋的機能性［J］.中國釀造，1995（4）：2～6.

15 朱正軍，孔國平，黃琴，等.楊梅醋的營養成分分析［J］.中國釀造，2009（1）：155～157.

16 李志英，張海容，梁會艷.5種葡萄酒清除羥自由基的比較［J］.釀酒科技，2006（4）：26～28.

17 林燕如，丁利君.番石榴葉中黃酮類物質提取及抗氧化性研究［J］.現代食品科技，2007，23（10）：58～60.

18 張文娜，張立杰，俞龍泉，等.桑椹果汁的抗氧化活性研究［J］.農產品加工，2011（8）：62～64.

19 Min－Sheng Su，Po－Jung Chien.Antioxidant activity，anthocyanins，and phenolics of rabbiteye blueberry（Vaccinium ashei）fluid products as affected by fermentation［J］.Food Chemistry，2007，104：182～187.

20 葉新紅.不同處理方法對葡萄汁中多酚類物質溶出效果及抗氧化活性影響的研究［D］.烏魯木齊：新疆農業大學，2009.

21 Oyaizu M.Studies on products of the browning reaction：Antioxidative acti vities of browning reaction products prepared from glucosamine［J］.Japanese Journal of Nutrition［Eiyogaku Zasshi］，1986（44）：307～314.