PCR 法快速檢測耐熱霉菌雪白絲衣霉

張 慧 鄭曉冬 姜 侃 汪 新 陳小珍

（1.浙江省質量檢測科學研究院食品檢測部，浙江 杭州 310013；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

耐熱性霉菌是引起果蔬汁飲料腐敗的重要原因之一［1－3］。它可產生子囊孢子，能夠耐受巴氏殺菌或UHT 殺菌而存活下來，并能在缺氧的環境中生長，抗熱能力比其它霉菌強很多。受耐熱霉菌污染的果汁，在貯存期間易發生變色、分層、胖聽等，甚至產生絲衣霉毒素A、棒曲霉素等有毒的次生代謝產物［4－6］，給食品安全帶來隱患，也給企業帶來經濟損失。一些企業尤其是出口型企業，為滿足國際需求，通常要求產品中耐熱霉菌不得檢出。目前耐熱霉菌的檢測通常采用PDA 平板培養法，但檢測時間較長［1］，影響了果蔬汁產品的快速流通。為保障國內外消費者的健康安全，急需尋找一種能夠快速檢測鑒別果汁中耐熱霉菌的方法。

雪白絲衣霉菌是果汁中易污染的耐熱霉菌之一［7－9］，本試驗根據雪白絲衣霉菌的beta－tubulin 基因序列，通過設計引物、條件優化等建立PCR 快速檢測方法，力圖快速、準確檢測果汁中雪白絲衣霉菌污染，為產品質量控制提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

本試驗所用菌株見表1。

1.1.2 主要儀器

電子天平：AB104－N，上海第二天平儀器廠；

梯度PCR 儀：Veriti 96孔，美國應用生物系統公司；

電泳儀：Bio－Rad PowerPace Basic，美國伯樂公司；

自動凝膠成像系統：Bio－Rad Gel Doc XR，美國伯樂公司；

高速離心機：Microfuge 16，貝克曼庫爾特商貿有限公司。

1.1.3 主要試劑

Biospin真菌基因組DNA 提取試劑盒：杭州博日科技有限公司；

2×NI－Taq PCR MasterMix試劑、DL2 000DNA Marker、瓊脂糖：上海位點生物科技有限公司。

表1 試驗菌株Table 1 Strains for test

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養 雪白絲衣霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養基，25 ℃培養3～5d，挑取菌絲體或菌絲球提取真菌DNA。

1.2.2 模板DNA 制備 真菌DNA 提取采用Biospin真菌基因組DNA 抽提試劑盒，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.3 引物設計 雪白絲衣霉菌引物設計參考GenBank CBS133.37beta tubulin的部分基因序列，雪白絲衣霉菌引物序列見表2，所有引物均由Invitrogen公司合成。

表2 引物組與退火溫度Table 2 Specific primer sequences and annealing temperatures

1.2.4 用于引物篩選的PCR 反應體系和PCR 反應體系的優化 雪白絲衣霉菌的引物篩選和退火溫度的優化同時進行，引物篩選時，使用雪白絲衣霉菌的引物，分別使用雪白絲衣霉菌（ATCC22260）、純黃絲衣霉（ATCC24474）、宛氏擬青霉（CICC4024）、費氏新薩托菌（ATCC24474）的DNA 模板，通過不同退火溫度下引物的特異性篩選出合適的引物。

PCR 反應條件：95 ℃（5min），98 ℃（10s）、梯 度 退火溫度（30s）、72℃（30s）、35個循環，72℃（5min）；做梯度PCR進行引物篩選和條件優化時，退火溫度梯度選擇：55，57，59，61，63，65 ℃。4 ℃保存。

引物濃度的優化：使用優化的退火溫度，引物的終濃度分別達到0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μmol／L，進行PCR 試驗。

表3 PCR 反應體系組成Table 3 PCR reaction

1.2.5 特異性驗證 分別應用2株雪白絲衣霉菌和6株非雪白絲衣霉菌，提取其基因組DNA 進行PCR 檢測，驗證該方法檢測雪白絲衣霉的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗 以標準菌株：雪白絲衣霉ATCC22260為參考菌株，進行靈敏度測定，將菌株DNA 提取液進行10倍梯度稀 釋，使DNA 濃度 約 為10，1，10－1，10－2，10－3，10－4ng／μL，DNA 模板用量為1.0μL，應用以上DNA 進行PCR 檢測，電泳觀察結果。

1.2.7 PCR 產物電泳 取5μL PCR產物，應用瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為0.5×TBE、2.0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條件下電泳30min，凝膠電泳成像系統觀察擴增結果。

2 結果與分析

2.1 引物的篩選和退火溫度的優化

運用梯度PCR 方法對雪白絲衣霉進行擴增，并對該菌不同退火溫度下的引物特異性進行考察，使用兩對引物進行PCR 反應，擴增產物電泳檢測結果見圖1、2。使用Bn－1引物的雪白絲衣霉（圖1）在退火溫度55，57，59，61，63 ℃時，123bp處均有目的條帶出現，59 ℃時呈現最強熒光，而在這些退火溫度均無非特性擴增出現，說明引物適合雪白絲衣霉的DNA 擴增，并具有良好的特異性。使用Bn－2引物進行梯度PCR 反應時（圖2），雪白絲衣霉在55，57，59，61 ℃時，均有72bp的目的條帶出現；同時，純黃絲衣霉在這幾個溫度均有明顯的非特異性擴增，退火溫度提升到63 ℃時，純黃絲衣霉非特異性擴增消失，但此時雪白絲衣霉的條帶亮度很弱；宛氏擬青霉在55，57 ℃時也出現了非特異性擴增，但隨著退火溫度的升高，非特異條帶逐漸減弱，退火溫度達到59 ℃以上時，即可消除宛氏擬青霉非特異擴增的影響。

綜合考慮，選擇擴增后有目的條帶出現，并且引物特異性較好的Bn－1引物，作為雪白絲衣霉PCR 擴增的引物；選擇59 ℃作為以后PCR 擴增的退火溫度。

圖1 雪白絲衣霉（使用Bn－1引物）梯度PCR 反應產物電泳結果Figure 1 Electrophoresis of Gradient PCR products of Byssochlamys nivea

圖2 雪白絲衣霉（使用Bn－2引物）梯度PCR 反應產物電泳結果Figure 2 Electrophoresis of Gradient PCR products of Byssochlamys nivea（Bn－2primers）

2.2 引物濃度的優化

按照篩選的引物和優化的退火溫度，對引物濃度進行優化試驗。由圖3可知，除了引物終濃度在0μmol／L 時沒有條帶，引物濃度在0.1μmol／L 以上的均在預期位置擴增出清晰的目的條帶。因此，從0.1～0.5μmol／L均可滿足PCR對引物濃度的要求。既保證條帶明亮、清晰，又考慮到節約成本，選用0.2μmol／L為優化的引物終濃度。

2.3 特異性試驗

特異性試驗結果見圖4。2 株雪白絲衣霉均呈陽性擴增，其它幾種霉菌和細菌的檢測結果均為陰性，說明該法只與雪白絲衣霉發生特異性反應，不與其它真菌或細菌菌株產生交叉反應，設計的引物特異性很強，與預期結果相符。

2.4 靈敏度試驗

圖3 引物濃度對PCR 擴增的影響Figure 3 Effect of primers concentration on PCR amplification

圖4 雪白絲衣霉及非雪白絲衣霉PCR 反應產物電泳結果Figure 4 Electrophoresis of PCR products of Byssochlamys nivea and non－Byssochlamys nivea

圖5 雪白絲衣霉PCR 檢測靈敏度Figure 5 Sensitivity of PCR for Byssochlamys nivea

分別以不同的雪白絲衣霉DNA 模板濃度對PCR 方法的檢測靈敏度進行測試。由圖5可知，隨著DNA模板濃度的降低，反應條帶的亮度呈梯度下降，當DNA 模板濃度降至1ng／μL時仍可見較為明亮的目的擴增條帶，因此檢測靈敏度約為1ng／PCR 反應體系。

3 討論

本試驗根據Genbank公布的耐熱性霉菌——雪白絲衣霉的beta－tubulin基因序列，設計了兩對引物，參考文獻［10］并結合經驗，初步設定反應體系與溫度循環和退火溫度的梯度程序，通過兩對引物PCR 擴增效果的對比，發現引物Bn－1既能擴增出目的DNA 片段，又具有良好的特異性；59 ℃的退火溫度和0.2μM／PCR 反應體系的引物濃度，在滿足試驗需求的同時，也節約了成本，為PCR 反應的最佳條件；以優化的PCR 條件對雪白絲衣霉和非雪白絲衣霉進行PCR 檢測，試驗結果表明所建立的PCR 方法對雪白絲衣霉具有良好的特異性，方法基因組DNA 的靈敏度為1ng／PCR 反應體系，檢測靈敏度好。雪白絲衣霉PCR 檢測方法的建立，為果汁中耐熱霉菌的快速檢測和鑒別提供了試驗數據。

1 郭偉鵬，吳清平，張菊梅，等.果汁飲料中耐熱霉菌的分離和鑒定研究［J］.生物技術通報，2008（增刊）：244～247.

2 祝紅昆.耐熱性霉菌引起果蔬汁飲料腐敗問題的實驗探討［J］.云南大學學報（自然科學版），2008，30（S1）：359～362.

3 郝天婷，周幗萍.2例果汁飲料中污染真菌的鑒定分析［J］.中國釀造，2010（9）：155～157.

4 Sant’Ana A S，Simas R C，Almeida C A，et al.Influence of package，type of apple juice and temperature on the production of patulin by Byssochlamys nivea and Byssochlamys fulva［J］.Int.J.Food Microbiol，2010，142（1－2）：156～163.

5 Tournas V.Heat－resistant fungi of importance to the food and beverage industry［J］.Crit Rev Microbiol，1994，20（4）：243～263.

6 Dombrink－Kurtzman M A，Engberg A E.Byssochlamys nivea with patulin－producing capability has an isoepoxydon dehydrogenase gene（idh）with sequence homology to Penicillium expansum and P.griseofulvum ［J］.Mycol Res.，2006，110（9）：1 111～1 118.

7 Silva F V，Gibbs P.Target selection in designing pasteurization processes for shelf－stable high－acid fruit products［J］.Crit Rev Food Sci.Nutr.，2004，44（5）：353～360.

8 Bayne H G，Michener H G.Heat resistance of Byssochlamysascospores［J］.Appl.Environ.Microbiol.，1979，37（4）：449～453.

9 Butz P，Funtenberger S，Haberditzl T，et al.High pressure inactivation of Byssochlamys niveaascospores and other heat resistant moulds［J］.LWT－Food Science and Technology，1996，29（5）：404～410.

10 Motolazu Nakayama，Kouichi Hosoya，Tetsuhiro Matsuzawa，et al.A rapid method for identifying Byssochiamys and Hamigera［J］.Journal of Food Protection，2010，73（8）：1 486～1 492.