鰱魚糜漂洗液中蛋白質分析與回收

許艷順 高 琪 姜啟興 夏文水

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

在魚制品加工中，魚糜制品因其高蛋白、低脂肪、口感嫩爽等特點已成為深受國內外消費者歡迎的水產加工大類產品，在中國已形成一定的產業化規模，并且發展迅速，產量和消費量逐年增加。在魚糜生產過程中，魚肉必須經過多次漂洗以除去部分阻礙魚糜凝膠形成和影響魚糜感官品質的酶類、脂肪、色素、無機鹽等雜質，同時引起大量蛋白質主要是水溶性蛋白質的損失，導致魚糜得率降低［1］。漂洗廢水中一般含有0.5%～2.3%的蛋白質，直接排放不僅污染環境，同時還造成蛋白質資源的浪費［2］。因此，對魚糜漂洗廢水中蛋白質進行回收利用，可以降低魚糜漂洗廢水對環境的污染，同時可以提高資源利用率和企業經濟效益。

近年來，對魚糜漂洗廢水中蛋白質的回收利用已引起國內外研究者的廣泛關注。目前魚糜漂洗廢水中蛋白回收方法主要有膜分離法［3］、絮凝法［4，5］、調節pH 值法［1，6］、電阻加熱法［7］等。膜分離法回收效果較好，但易導致膜污染；電阻加熱法耗能大，回收成本較高［8］。褐藻膠作為天然有機高分子絮凝劑對廢水中蛋白質具有較好的絮凝效果，且回收蛋白可回添至魚糜中［9，10］。蛋白質是帶有正電荷和負電荷基團的兩性電解質，利用蛋白質在等電點附近較低的溶解性來沉淀回收漂洗液中蛋白質，操作簡單，成本低廉［1］。

本試驗對鰱魚糜不同漂洗階段的漂洗液中蛋白含量和組成進行分析，并進一步采用調節魚糜漂洗液pH 法和海藻膠絮凝法對漂洗液中蛋白質進行回收和分析，旨在為淡水魚糜加工過程中漂洗廢水的回收處理提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鰱魚：鮮活，體重2～3kg／條，購于無錫某農貿市場；

四甲基乙二胺（TEMED）：純度≥99%，美國Sigma公司；

丙烯酰胺、N，N”－亞甲基雙丙烯酰胺：

純度＞98%，瑞士Fluka Biochemica公司；

β－巰基乙醇：純度98%，美國Amresco公司；

蛋白質分子量標準：寶生物工程（大連）有限公司；

其它試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高速冷凍離心機：4K－15型，德國Sigma公司；

紫外－可見分光光度計：UV－1000型，上海天美科學儀器有限公司；

pH 計：320－s型，梅特勒－托利多儀器上海有限公司；

多功能食品加工機：SQ2119DX 型，上海帥佳電子科技有限公司；

電泳儀：DYY－8C型，北京市六一儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 魚糜漂洗液制備 將新鮮鰱魚去頭、內臟，清水沖洗干凈后，采肉機采肉。漂洗時控制魚肉與水的比例為1∶4（m∶V），先慢速攪拌6min，再靜置10min，之后用4層紗布過濾，得到漂洗液置于4 ℃冰箱中備用（冷藏時間不超過24h）。在漂洗過程中應控制溫度不超過10 ℃。用清水漂洗兩次后，第3次漂洗采用0.3% （m∶V）鹽水漂洗。所得到的3次漂洗液依次記為WS－Ⅰ，WS－Ⅱ和WS－Ⅲ。

1.2.2 調節pH 法回收漂洗液蛋白質 分別取30mL 魚糜漂洗液于100 mL 燒杯中，用1 mol／L HCl調節漂洗液pH至pH 3.0～6.0（以0.5為梯度），漂洗液用蒸餾水分別補至40mL，然后在設定溫度條件下（4，21，30 ℃）靜置30min后4 000r／min離心10min，測定上清液的體積和蛋白質濃度，計算蛋白質回收率。

1.2.3 褐藻膠絮凝法回收漂洗液蛋白質 分別取30mL魚糜漂洗液于100mL錐形瓶中，用1mol／L HCl調節漂洗液pH 至3.0～6.0（以0.5為梯度），漂洗液用蒸餾水分別補至40mL，然后按100mg／L 添加1%褐藻膠溶液，錐形瓶用保鮮膜封口，放入搖床中，搖床參數設置為20 ℃，120r／min，5min后取出靜置30min，4 000r／min離心10min，收集上清液，測定上清液的體積和蛋白質濃度，計算蛋白質回收率。

1.3 分析方法

1.3.1 pH 的測定 采用pH 計直接測定。

1.3.2 蛋白質濃度測定 采用雙縮尿法。

1.3.3 蛋白質回收率計算 按式（1）計算：

1.3.4 SDS－PAGE 電泳 采用Laemmli法。將電泳蛋白樣品與等體積的SDS－PAGE 樣品處理液（0.125 mol／L pH 6.8Tris－HCl緩沖液，4%SDS，20%甘油，10%β－巰基乙醇，0.005% 溴酚藍）混合，沸水加熱5min后，采用4%的濃縮膠和12%的分離膠進行SDS－PAGE 電泳。起始電泳電壓為80V，待樣品進入分離膠后改為120 V。電泳完成后，采用考馬斯亮藍R250染色，用醋酸甲醇溶液進行脫色。

蛋白質分子量標準混合物：肌球蛋白（200kDa），β－半乳糖苷 酶（116 kDa），磷 酸 酶b（97.2 kDa），牛 血 清 蛋 白（66.4kDa），卵清蛋白（44.3kDa），磷酸苷酶（29.0kDa），胰蛋白酶抑制劑（20.1kDa），溶菌酶（14.3kDa）。

1.4 統計分析

每組試驗重復3次，取其平均值。所有數據采用Excel作圖，采用SPSS 11.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 魚糜漂洗液中蛋白含量和組成分析

由圖1可知，魚糜漂洗液中含有大量的蛋白質，3次漂洗液中蛋白質濃度分別為WS－Ⅰ（12.37±0.09）mg／mL，WS－Ⅱ（3.12±0.09）mg／mL，WS－Ⅲ（1.75±0.07）mg／mL，隨著漂洗次數的增加，漂洗液中蛋白含量逐漸減少。由圖2 可知，漂洗液WS－Ⅰ中蛋白質分子量分布在20.1～97.2kDa，其中主要蛋白組分集中在44.3kDa左右。漂洗液WS－Ⅱ和WS－Ⅲ中的蛋白質分子量也大部分處于29.0～66.4kDa，但含量比WS－Ⅰ顯著減少。因此，在蛋白回收研究中采用漂洗液WS－Ⅰ。

2.2 pH 值和溫度對蛋白回收效果的影響

圖1 不同漂洗階段漂洗廢水中蛋白質含量Figure 1 Protein concentration in surimi washwater at different wash stages

圖2 漂洗廢水中蛋白質SDS－PAGE電泳圖Figure 2 SDS－PAGE patterns of proteins in surimi wash－water at different stages

蛋白質是帶有正電荷和負電荷基團的兩性電解質，pH值能夠改變氨基酸殘基側鏈的電荷分布和蛋白分子帶電基團的電荷數量。當環境pH 值偏離等電點越近，蛋白分子所帶的靜電荷越少，蛋白分子在等電點處所帶靜電荷為零，蛋白分子間的靜電斥力最小，蛋白分子趨于聚集沉淀。因此調節pH 值的變化能夠降低或增加蛋白質之間的相互作用，從而影響蛋白質聚集沉淀。

不同pH 和溫度條件下魚糜漂洗液中蛋白回收效果見圖3。由圖3可知，在3個處理溫度條件下，隨著魚糜漂洗液pH 的降低，蛋白回收率均呈現先增加后降低的趨勢，在pH 5.0處蛋白回收率均達到最大，在4，21，30℃3個不同處理溫度條件下蛋白質最大回收率分別為42.73%，47.40%和54.81%。Bourtoom 等［1］通過調節pH 值對金線魚（threadfin bream）魚糜漂洗液中蛋白質的回收研究中發現，蛋白回收率隨pH 的下降而下降，在pH 3.5除蛋白回收率最大，為66.3%。Chen等［11］通過等點聚焦電泳（IEF）研究發現魚肉水溶性蛋白組分的等電點在3.5～5.2，5.85～6.55 和7.35～8.15處。溫度對蛋白回收效果有顯著影響，在選擇的3個處理溫度條件下，蛋白回收率隨著溫度的增加而逐漸增加，這與Bourtoom 等的研究報道［1］一致。

圖3 不同pH、溫度對蛋白質回收效果的影響Figure 3 Effect of pH and temperature on recovery of proteins in surimi wash water

由圖4可知，不同溫度條件下所得上清液中蛋白質電泳圖譜相似，表明處理溫度對回收蛋白質組成影響不大。但不同pH 條件下上清液中蛋白電泳圖譜條帶顯著不同，隨著pH 的降低，較高分子量蛋白條帶，尤其是分子量在44.3kDa左右的蛋白質電泳條帶逐漸變淡，而低分子量蛋白質（14.3～20.1kDa）的電泳條帶強度逐漸增加，表明隨著pH的降低，較高分子量蛋白質部分水解為低分子量蛋白質，而且當pH 值低于5.0 時，蛋白降解愈加明顯。由電泳圖譜（圖4）可知，當pH 小于5.0時蛋白回收率逐漸下降可能是由于在較低pH 條件下蛋白分子降解為低分子量的多肽，蛋白溶解性增加，導致沉淀回收的蛋白質量減少。

2.3 pH 值對褐藻膠絮凝回收蛋白效果的影響

圖4 不同pH、溫度對離心上清液中蛋白質SDS－PAGE圖譜的影響Figure 4 Effect of pH and temperature on SDS－PAGE patterns of protein in supernatant

圖5 pH 對褐藻膠絮凝回收漂洗液中蛋白質效果的影響Figure 5 Effect of pH on protien recovery from surimi wash water using alginate

褐藻膠作為絮凝劑已廣泛用于食品加工廢水處理中。由圖5可知，pH 對褐藻膠絮凝回收蛋白效果影響顯著，且褐藻膠絮凝回收率隨pH 的變化與單獨調節pH 的蛋白回收率變化趨勢一致。隨著pH 的降低褐藻膠絮凝回收率呈現先增加后降低的趨勢，在pH 5.0時蛋白回收效果最好，蛋白回收率回收率達到70.25%。海藻膠絮凝法與調節pH 法相比，當pH 小于3.5時，海藻膠絮凝法回收蛋白質沒有優勢；當pH 大于3.5時，在相同pH 條件下海藻膠絮凝法的蛋白回收率較單獨調節pH 法顯著提高，在pH 5.0時褐藻膠絮凝回收率比單獨調節pH 的空白組回收率（47.40%）高出22%。結果表明，褐藻膠絮凝法結合調節pH 法可顯著提高漂洗廢水中蛋白質的回收效果。張宗恩等［10］研究發現，褐藻膠回收魚糜漂洗液中的蛋白質在pH 3.78～4.92范圍內具有較好的回收效果。

3 結論

（1）鰱魚糜漂洗液中含有大量較低分子量的水溶性蛋白質組分，且蛋白質主要集中在第1次漂洗液中，生產過程中需重點對第1次漂洗液中蛋白質進行回收利用。

（2）通過調節魚糜漂洗液pH 值和控制適當的處理溫度可有效回收漂洗液中的蛋白質。該方法操作簡單，但單獨調節pH 法的蛋白回收率不是很高，調節pH 法結合褐藻膠絮凝法可顯著提高漂洗液中蛋白質的回收效果。

（3）本試驗雖比較了不同方法對魚糜漂洗液中蛋白質的回收效果，但對于回收蛋白質的功能性質和應用還需進一步研究。

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