茶鮮葉酶促氧化合成茶黃素研究

龔志華 李 徐 朱盛堯 陳 朵 肖文軍，3

（1.湖南農業大學茶學系，湖南 長沙 410128；2.長沙和潤茶業科技有限公司，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學植物資源工程系，湖南 長沙 410128）

茶黃素是由茶多酚、兒茶素及其衍生物氧化縮合而來的，且溶于乙酸乙酯呈橙黃色的一類物質，被譽為茶葉中的腦黃金［1］。目前已經發現并鑒定的茶黃素及其前導物共有15種，并一致認為茶黃素（TF）、茶黃素－3 沒食子酸（TF－3－G）、茶黃素－3’－沒食子酸酯（TF－3’－G）和茶黃素雙沒食子酸酯（TFDG）是4種主要的茶黃素［2］。由于茶黃素在穩定性以及抗過敏、防治心血管疾病等功能上遠優于兒茶素，使得高茶黃素制品的市場需求旺盛且供不應求，這主要源于中國紅茶茶黃素含量較低（≤0.7%）以及通過提取分離紅茶茶黃素的方法來制備茶黃素等客觀原因［3－5］。為提高制備茶黃素的原料基質的茶黃素含量，國內外學者采用茶鮮葉勻漿模擬發酵法、其它植物多酚氧化酶酶促發酵法以及微生物酶促發酵法合成茶黃素［6－10］，但由于受到茶葉生產季節、多酚氧化同工酶的多樣性以及優勢微生物菌種篩選的成功性小等原因的局限，酶促生物發酵制備茶黃素未能取得突破性進展。試驗在前期研究的基礎上，比較研究政和大白茶、秀紅、碧香早3種茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的效率，優化篩選最優茶鮮葉原料酶促合成茶黃素工藝技術參數，旨在為茶黃素的高效制備提供技術支持與數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茶鮮葉原料：根據預試驗中對12種茶鮮葉酶促合成茶黃素的檢測結果，選擇湖南農業大學長安教學實習基地春季大葉種－政和大白茶、中葉種－碧香早、小葉種－秀紅的一芽二葉茶鮮葉作為試驗原料。

1.2 試劑與儀器設備

1.2.1 試劑

鄰苯二酚、檸檬酸、冰乙酸、磷酸氫二鈉、石英砂：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙腈：色譜純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；

乙酸乙酯：色譜純，天津市津科精細化工研究所；

N，N－二甲基甲酰胺：色譜純，天津市科密歐化學試劑開發中心；

甲醇：色譜純，上海振興化工一廠。

1.2.2 儀器設備

電子天平：FAZ104S型，上海精科科學儀器有限公司；

組織搗碎勻漿機：FS－1（YQ－3）型，上海浦東物理光學儀器廠；

臺式高速冷凍離心機：TDL5M 型，長沙英泰儀器有限公司；

大容量常溫離心機：DD5型，長沙英泰儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH 型，金壇市金城國勝實驗儀器廠；

紫外分光光度計：UV－2100型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

高效液相色譜儀：LC10AT－VP Plus型，日本島津公司；

鼓風干燥箱：DHG－9240A 型，上海一恒科技有限公司；

干燥機：XMY 型，上海市實驗儀器總廠；

超聲波清洗機：KQ－100 型，昆山市超聲波儀器有限公司。

1.3 試驗設計與方法

1.3.1 試驗設計 試驗設計見圖1。

圖1 試驗設計圖Figure 1 The design of the test

1.3.2 方法

（1）酶促氧化反應底物制備：稱取政和大白茶、碧香早、秀紅的茶鮮葉各2g，分別加入45mL預冷pH 4.8檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液，組織勻漿5 min后，立即沸水浴鈍化酶活3～4min。冷卻，轉入離心管，常溫下于4 000r／min離心15min，將離心后的上清液定容至100mL，檢測兒茶素含量，作為酶促反應底物備用。

（2）酶液制備：稱取政和大白茶的茶鮮葉0.12g，加入少許緩沖溶液及石英砂研磨成漿，4℃下于4 000r／min冷凍離心15min，取上清液定容至15mL，放入4 ℃的冰箱，作為酶源備用。

（3）酶促氧化反應：將以上制備好的反應底物分別移入100mL三角瓶中，放入30 ℃的水浴鍋中預熱10min，然后用移液管移取5mL酶液于三角瓶中，搖勻，90min后沸水浴終止反應，取10mL反應液檢測兒茶素和茶黃素含量。

（4）酶促氧化合成茶黃素的最優茶鮮葉原料篩選：以春季政和大白一芽二葉茶鮮葉勻漿液為酶源，以單位質量茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的量為考察指標，比較研究政和大白茶、秀紅、碧香早3種茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的效率以及各原料在酶促反應前后的兒茶素變化，篩選酶促氧化合成茶黃素的最優茶鮮葉原料。

（5）最優茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的單因素試驗：以春季政和大白一芽二葉茶鮮葉勻漿液為酶源，以單位質量最優茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的量為考察指標，依次研究酶促反應體系pH 值、溫度、時間、酶源用量4個因子對合成茶黃素的影響；各因素的水平設置見表1。

表1 單因素試驗因素水平表Table 1 The level of single factor test

（6）最優茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的正交試驗：根據單因素試驗結果，以單位質量最優茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的量為考察指標，選擇影響顯著因素及其合理水平進行正交試驗，優化最優茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的工藝技術參數。

（7）最優正交組合的驗證性實驗：對正交試驗中所得的最優組合進行3次驗證性實驗，驗證所得實驗結果的準確性與穩定性。

1.3.3 檢測方法

（1）茶黃素檢測方法：參照文獻［11］。

（2）兒茶素檢測方法：參照文獻［12］。

2 結果與分析

2.1 酶促氧化合成茶黃素的最優茶鮮葉原料篩選

不同品種茶鮮葉原料作為底物對合成茶黃素的影響見表2。由表2可知，茶黃素合成總量（TFs）以政和大白茶的最多，其次為碧香早、秀紅，同時，不同品種茶鮮葉合成茶黃素的各個單體含量存在差異。以碧香早為底物，合成的茶黃素中TF、TF－3－G占主導地位；而以政和大白、秀紅作為底物合成的茶黃素中，TF、TF－3－G、TFDG 合成量相當，TF－3’－G相對較少。這與茶黃素合成的過程中實際消耗的兒茶素種類有關系。

表2 不同茶樹品種鮮葉原料對合成茶黃素的影響Table 2 Effect of fresh leaves of tea varieties on synthesizing theaflavins／（mg·g－1·Fresh Leaves）

由表3可知，政和大白茶鮮葉原料反應后EGCG、EGC、EC、ECG 含量減少，而DL－C、GCG 的含量增加；秀紅茶鮮葉原料反應后EGC、EC 也減少，其它兒茶素各單體均增加；碧香早茶鮮葉原料反應后EGC、DL－C、EC、ECG 含量減少，GCG 增加。同時，單位質量政和大白茶和秀紅鮮葉的EGCG、ECG、EGC、EC 含量顯著高于碧香早。因此，EGCG、ECG、EC含量較高的茶鮮葉品種原料有利于合成茶黃素。這主要是由于茶黃素類化合物是由成對的兒茶素經過多酚氧化酶催化形成鄰醌，B環上有2個鄰位羥基的簡單兒茶素（L－EC，L－EGC）與B 環上有3個鄰位羥基的沒食子兒茶素（L－ECG 和L－EGCG）共同存在時，它們氧化后的鄰醌B環之間可縮和形成茶黃素［12］。因此，選擇政和大白茶鮮葉作為后續酶促氧化合成茶黃素的最優茶鮮葉原料。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 酶促反應體系pH 值對合成茶黃素的影響 由圖2

表3 不同茶樹品種鮮葉原料反應前后兒茶素的變化Table 3 Change of catechins in reacting system of different tea fresh leaves／（mg·g－1·Fresh Leaves）

可知，隨著pH 的增加，茶黃素各個單體及其總量均呈現出先緩慢增加后減少的趨勢，當pH 為5.0 時，各個單體及其總量均達到最大值。其中，TFDG 變化最為突出，大約減少了35.7%，其次為TF－3’－G。因此，pH 5.0是合成茶黃素的適宜pH 值。

圖2 酶促反應體系pH 值對合成茶黃素的影響Figure 2 Effect of pH value in the reacting system on the systhsis of theaflavins

2.2.2 酶促反應體系溫度對合成茶黃素的影響 由圖3可知，當反應體系的溫度從20 ℃上升至30 ℃時，茶黃素各個單體的量及其總量均大幅增加，這說明在一定溫度內，隨著溫度的上升，多酚氧化酶的活性增強，酶促氧化合成茶黃素的量增加；當溫度上升至30 ℃后，TFs、TF、TF－3－G 及TF－3，－G 的合成量開始下降；當溫度上升至40℃后，茶黃素各組分合成量均逐漸降低。

圖3 酶促反應體系溫度對合成茶黃素的影響Figure 3 Effect of temperature in the reacting system on the systhsis of theaflavins

2.2.3 酶促反應時間對合成茶黃素的影響 由圖4可知，隨著酶促反應時間的延長，茶黃素的合成量先逐步增加，當反應進行到120min時，單位質量茶鮮葉酶促合成茶黃素的總量達到最大值，隨后茶黃素的合成總量開始下降。

2.2.4 酶源添加量對合成茶黃素的影響 由圖5可知，酶源添加量在0.2～0.6g／100mL時，反應體系中茶黃素的合成總量隨酶源添加量而逐漸增加，其中TF的合成量增加明顯，當酶源添加量在0.6～1.0g／100mL 時，各茶黃素組分的合成量無明顯變化，而茶黃素總量有逐漸下降的趨勢，這可能是茶黃素在酶的作用下，進一步氧化聚合成茶紅素的緣故［13］。

圖4 酶促反應時間對合成茶黃素的影響Figure 4 Effect of enzymatic reacting time on the systhsis of theaflavins

圖5 不同酶源添加量對合成茶黃素的影響Figure 5 Effect of adding enzyme amount on the systhsis of theaflavins

2.3 正交試驗結果與分析

根據單因素試驗結果，以政和大白春茶為原料，選擇酶促反應體系pH 值、反應時間、反應溫度、酶源添加量4個因素，設置4因素3水平L9（34）正交試驗（表4），試驗結果見表5。

表4 正交試驗設計表Table 4 Orthogonal test design

由表5可知，在酶促反應體系pH 值、反應時間、溫度、酶源添加量4個影響因子中，對TFs影響大小的順序依次為B＞D＞A＞C，結合茶黃素總量的均值、極差分析結果，可以看出酶促合成茶黃素的最佳組合是B2D2A3C3，即反應時間為120min、酶源添加量為0.6g／100mL、pH 值為5.2、反應溫度為35 ℃。

表5 酶促合成茶黃素的正交試驗結果與分析Table 5 Results of orthogonal test of enzyme synthesizing theaflavins

2.4 最優組合驗證性實驗

對獲得的最優工藝技術組合A3B2C3D2進行3 次驗證性實驗。結果表明，3 次驗證試驗的茶黃素合成量分別為2.73，2.70，2.74mg／g·鮮葉，平均為2.72mg／g·鮮葉，說明所得工藝技術組合具有很好的重復性和準確性。

3 結論

試驗結果表明，政和大白茶、秀紅、碧香早3種茶鮮葉原料在酶促氧化合成茶黃素的效率上存在較大差異，其中以政和大白茶鮮葉原料合成茶黃素的總量最多，最適合于酶促氧化合成茶黃素，這主要是由于3種茶鮮葉原料的兒茶素組成及其含量不同所致。政和大白茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素最優工藝技術參數：酶源用量為0.6g酶液／100mL，酶促反應時間為120min，反應體系溫度為35 ℃，反應體系pH值為5.2。在該參數下，茶黃素的合成量達2.72 mg／g·鮮葉，說明所得工藝技術是一種利用茶鮮葉原料酶促氧化高效制備茶黃素的方法。

同時，試驗過程中，由于酶促合成體系的量較小，酶促反應料液與空氣接觸充分，有充足氧供給，所以沒有考慮通氧量的問題，但在工廠化酶促合成茶黃素的過程中，反應體系的體積量較大，反應料液很難與空氣或氧氣充分接觸，將會影響酶促合成茶黃素的效率。因此，當工廠化酶促合成茶黃素時，尚需解決通氧的問題。

1 江和源，程啟坤，杜其珍.高效逆流色譜法分離純化茶黃素［J］.天然產物研究與開發，2000，12（4）：30～35.

2 王坤波，劉仲華，黃建安.茶黃素形成機理的研究進展［J］.茶葉通訊，2001，28（2）：34～36.

3 Lai Kwok Leung，Yalun Su，Ruoyun Chen.Theaflavins in black tea and catechins in green tea are equally effective antioxidants［J］.Journal of Nutrition，2001，131（9）：2 248～2 251.

4 Sarkar A，Bhaduri A.Black tea is a powerful chemopreventor of reactive oxygen andnitrogen species：Comparison with its individual catechin constituents and green tea［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，284（1）：173～178.

5 Lin Y L，Tsai S H，Lin－Shiau S Y，et al.Theaflavin－3，3’－digallate from black tea blocks the nitric oxide synthase by down－regulating the activation of NF－kappa B in macrophages［J］.European Journal of Pharmacology，1999，367（2～3）：379～388.

6 夏濤，高麗萍.茶鮮葉勻漿懸浮發酵體系優化模型［J］.茶葉科學，1999，19（1）：55～60.

7 吳紅梅.多酚氧化酶酶源篩選及酶法制取茶色素研究［D］.合肥：安徽農業大學，2004.

8 楊賢強，王岳飛.茶多酚化學［M］.上海：上海科學技術出版社，2003.

9 谷記平，劉仲華，黃建安，等.酸性氧化合成茶黃素條件優化的研究［J］.茶葉科學，2006，26（4）：285～290.

10 Sanderson G W.The chemistry of tea and tea manufacturing［M］.NewYork：Academic Press，1972：247～316.

11 李大祥，宛曉春，夏濤，等.茶色素中茶黃素類的HPLC定量［J］.茶葉科學，2004，24（2）：124～128.

12 王坤波，劉仲華，趙淑娟，等.兒茶素組成和理化條件對茶黃素酶催化合成的影響［J］.茶葉科學，2007，27（3）：192～200.

13 王坤波.茶黃素的酶促合成、分離鑒定及功能研究［D］.長沙：湖南農業大學，2007.