食品微生物檢測技術研究進展

王秀芹，張 敏，顏 萍

(1.朝陽師范高等專科學校，遼寧 朝陽 122000;2.北京匯源飲料食品集團有限公司檢測中心，北京 101305;3.山東省膠州市質量技術監督局，山東膠州 266300)

隨著科學技術的不斷提高，人民生活水平的日益增長，食品的安全問題越來越成為人們關注的焦點，食品中暴露出的問題也越來越多，人們對于食品的安全則有了更高的要求。國家對于食品衛生的檢測力度也逐漸增強，食品微生物檢驗是評價食品衛生質量、保證食品安全、預防和控制食源性疾病的重要手段之一。因此，食品中關于微生物檢測方法和技術的探討也顯得尤為重要。

1 分子生物學方法

1.1 PCR 檢測

PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈反應，是由Kary Mullis等人首創的一項體外快速擴增DNA的方法，它可使極微量的某一特定序列的DNA片斷在數小時內特異性擴增至百萬倍以上［1］。PCR 反應是將模板 DNA、引物、Taq酶、dNTPs、鎂離子、緩沖液、雙蒸水等混合物裝在PCR微型管中，在可編程調控的PCR儀上完成。

PCR技術具有簡易、快速、靈敏和高特異性的優點，可以擴增待檢微生物目的DNA很快判斷某種微生物是否存在。PCR技術還可以檢測那些人工無法培養或難以培養的微生物，從而大大增加診斷檢查內容和診斷能力。目前，已經有了自動化PCR檢測試劑盒儀器，使用比較方便，但仍然需要增加一些專用的設備。PCR技術可以對特定的致病菌進行檢測，已經成功地對沙門氏菌［2］、大腸埃希菌 O157∶H7［3］、產單核細胞李斯特菌［4］等致病菌進行了有效測定。PCR技術也存在著假陽性問題、假陰性問題以及定量困難的問題，所以還不能成為一種常規檢測方法。

1.2 核酸探針技術

核酸探針技術是用同位素或其他的標記方法對已知核苷酸序列DNA片段進行標記，將其加入到已變異的DNA樣品。這樣在一定的條件下就能和這種樣品的同源序列的DNA區段形成雜交雙聯，達到鑒定DNA的目的。核酸探針檢測技術具有特異性、敏感性的優點，但也存在一些問題，如一種菌需要制備一種探針;對樣品進行一段時間的培養才能達到檢測量;對毒素污染的不含產毒菌的食品無法檢測［5］。

2 代謝學技術

2.1 電阻抗技術

電阻抗技術是近年來發展起來的一項生物學技術，已經開始應用于微生物的檢測。它是指細菌在培養基內生長繁殖的過程中，將會使培養基中的大部分電惰性物質，代謝為具有電活性的小分子物質，其能增加培養基的導電性，使阻抗發生變化，通過檢測培養基的電阻抗變化來判定細菌在培養基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應的細菌。該方法已用于食品中細菌總數、大腸埃希菌、沙門氏菌等［6］微生物的檢測，且具有高敏感性、特異性、快速反應性和高度重復性等優點。

2.2 微熱量計技術

微熱量計技術是通過細菌生長時熱量的變化對細菌進行檢出和鑒別。微生物在生長過程中產生熱量，用微熱量計測量產熱量等數據，存儲于計算機中，經過適當信號上的數字模擬界面，在記錄器上繪制成以產熱量對比時間組成的熱曲線圖，與已知細菌熱曲線圖比較，即可對細菌進行鑒別。目前，應用該技術研究細菌的抑制作用［7］。

2.3 放射測量技術

放射測量技術(RM)是物理與化學診斷一體的新型檢測技術，主要用于培養基中微生物的檢驗。根據細菌在生長繁殖過程中代謝碳水化合物產生CO2的原理，把微量的放射性14C標記引入碳水化合物或鹽類等底物分子中進行檢測的技術［8］。細菌生長時，這些底物被利用并釋放出含放射性的14CO2，然后自動化放射測定儀Bactec測量14CO2的含量，來判斷細菌的數量。本方法具有快速、準確度高和自動化等優點。放射測量技術已經被應用于大腸埃希菌的定量檢測。

3 免疫分析檢測

3.1 免疫熒光技術

免疫熒光技術(immunofluorescence Technique)就是用熒光素標記的抗體檢測抗原或抗體的免疫學標記技術又稱熒光抗體技術。所用的熒光素標記抗體通稱為熒光抗體。實際應用上主要有直接法和間接法。直接熒光抗體檢測法是在檢樣上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，經洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。間接法是在檢樣上滴加已知細菌特異性抗血清，待作用后經洗滌，再加入熒光標記的抗體后在熒光顯微鏡下觀察結果。可用來對沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E.coli O157和單核細胞增生李斯特氏菌等進行快速檢測。王軍等［9］建立了養殖大黃魚病原溶藻弧菌的間接熒光抗體免疫快速檢測技術。該技術的主要特點是特異性強、敏感性高、速度快。但是還存在一定的不足，如非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序比較復雜。

3.2 酶聯免疫吸附技術

酶聯免疫吸附技術 ELISA技術(enzyme，linked fluorescent immunoassay)，全稱熒光酶標免疫分析，最早出現于19世紀70年代，它是在酶聯免疫吸附分析的基礎上發展起來的一種快速、先進的現代食品微生物分析檢測方法，最近幾年出現了更靈敏的顯色劑和底物，提高了ELISA的有效性。ELISA技術是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶染色，底物顯色后，通過定性或定量分析有色產物量即可確定樣品中待測物質含量。它結合了免疫熒光法和放射免疫測定法2種技術的優點，具有可定量、反應靈敏準確、標記物穩定、適用范圍寬、結果判斷客觀、簡便完全、檢測速度快以及費用低等特點，可同時進行上千份樣品的分析。近年來，ELISA技術已經逐步應用與食品中大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等方面的檢測分析［10］。

酶聯熒光免疫分析技術是將酶系統與熒光免疫分析結合起來，在普通酶免疫分析的基礎上用理想的熒光底物代替生色底物，可提高分析的靈敏度和增寬測量范圍，減少試劑的用量。酶放大技術、同相分離及熒光檢測三者的聯合將成為熒光免疫分析中最靈敏的方法。

4 分析化學技術

分析化學技術的不斷更新，使儀器分析手段和方法在微生物檢測方面取得了一定的地位。如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LCMS/MS)等。這些方法不同于依賴微生物生物學特征的檢測方法，而是通過分析微生物的化學組成(生物標志物)來區分和鑒定微生物，開辟了檢測和鑒定微生物的新途徑。例如:氣相色譜分析是利用微生物細胞分離的方法研究微生物分類的。其原理是將微生物細胞經過水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后使之分離盡可能多的化學組分供氣相色譜儀進行分析。得到特征峰來進行微生物鑒定。大量分析檢測各種常見細菌、酵母菌、霉菌和其他微生物的組成成分，并建立微生物組分標準色譜圖文庫，然后將待鑒定微生物的組分色譜圖與標準圖譜相比較，迅速鑒定其種類［11］。

5 展望

伴隨著微生物檢測技術的不斷發展進步，檢測的方法也越來越多樣化，除了上述介紹的幾種方法以外還包括基因芯片檢測、流式細胞術、免疫磁性微球等檢測方法。每一種檢測方法都有其自己的優點和缺點，在檢測時要根據自己的實際情況選擇適合的方法，還可以適當的選擇幾種方法結合起來使用，以提高檢測的準確性。

目前食品安全是一個重大的世界性公共衛生問題，不僅影響到人類的健康，而且關系到國家的穩定。雖然病菌不斷的進化，但是檢測方法也在不斷的改進，相信在不久的將來會研發出更加簡單快速的病原微生物檢測方法和檢測體系，為社會的飲食安全把好關，這也必將為人類的公共衛生、營養健康、飲食習慣與疾病預防事業做出巨大的貢獻。今后食品微生物檢驗技術將會向高效率、高標準、高精準度、高靈敏度的方向發展。

［1］迪芬巴赫C W著，黃培堂譯.PCR技術實驗指南［M］.北京:科學出版社，2000.

［2］劉光明，徐慶研，龍敏南，等.應用PCR-ELISA技術檢測轉基因產品的研究［J］.食品科學，2003，24(1):101-105.

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［4］Walser P E.Using conventional micro titer plate technology for the automation of microbiology testing of drinking wate［J］.J Rapid Methods Automat Microbial，2000，8(3):193-208.

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［6］陳廣全，張惠嬡，饒紅，等.電阻抗法檢測食品中沙門氏菌［J］.食品科學，2001，22(9):66-70.

［7］劉永軍，南昭東，孫海濤，等.限制性條件下藥物對細菌抑制作用微量量熱法研究［J］.生物工程學報，1996，12(1):60-64.

［8］林蕾，張煒.食品微生物檢驗技術的研究進展［J］.現代農業科學，2008，15(10):97-99.

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［10］寇運同，張明玉，韓青，等.熒光酶標分析系統快速檢測食品中的沙門氏菌［D］.中國動物栓疫，2000，17(9):39-40.

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