對乙型肝炎病毒耐核苷(酸)類似物機制的新認識

范志遠，于德敏，張欣欣

1. 上海交通大學醫學院瑞金臨床醫學院醫學系，上海 200025； 2. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院感染科，上海 200025

抗病毒是目前治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的重要手段，主要藥物有干擾素類和核苷(酸)類似物，后者包括L-核苷(酸)類的拉米夫定(lamivudine，LAM)和替比夫定(telbivudine，LdT)、無環磷酸鹽類的阿德福韋酯(adefovir dipivoxil，ADV)和替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)、環戊烷/烯類的恩替卡韋(entecavir，ETV)[1]。核苷(酸)類藥物因具口服方便、不良反應少、應答率高等優點而廣泛使用，但主要缺點是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)對部分核苷(酸)類藥物累積耐藥的發生率較高，且需長期甚至終身服藥。現就近年來有關CHB治療中HBV對核苷(酸)類似物耐藥機制的研究進展作一綜述。

1 對核苷(酸)類藥物耐藥通路的新認識

1.1 M204I/V通路

有關研究表明，YMDD突變(rtM204I/V)相關通路或稱M204I/V通路是HBV對L-核苷(酸)類藥物耐藥的主要通路，與其他藥物無明顯相關性[2]。但M204I/V并非HBV耐LAM的唯一通路，也并非只在HBV耐LAM中起作用。已有研究發現，L80I、V173L、A181V/T等通路亦可作為HBV對LAM耐藥的通路[3-6]。另外的研究則顯示，M204V 通路與HBV耐ETV相關[7]，M204I通路則與HBV耐LdT相關，且為HBV耐LdT主要通路[8]。

因此，M204I/V通路是HBV對LAM、ETV、LdT發生交叉耐藥的重要通路，即一旦HBV對LAM產生耐藥，用ETV及LdT替代治療也可能面臨失敗。

1.2 L180M、V173L與L80V/I通路

已有研究表明，rtL180M、rtV173L及rtL80V/I突變往往并不單獨存在，而是伴隨rtM204I/V突變出現，且這些突變通常起代償作用，可恢復HBV DNA聚合酶因rtM 204I/V突變而降低的復制適應性[9]。另2項研究[10,11]也顯示，rtM204I/V與rtL180M、rtL80V/I在HBV對L-核苷(酸)類藥物耐藥發生中有很強的關聯性。

據目前研究，L180M、V173L、L80V/I這3條通路的主要作用是對M204I/V通路起代償補充作用，協助M204I/V通路在HBV對L-核苷(酸)類藥物耐藥機制中發揮重要作用。

1.3 N236T與I233V通路

Angus等[12]及Hadziyannis等[13]均在ADV治療期間發生臨床耐藥的患者HBV中發現了rtN236T和rtA181V/T突變，且兩者與HBV耐ADV明顯相關。另外，Osiowy等于2006年的研究也得出類似結論[14]。這些研究提示，HBV耐ADV的發生與N236T、A181V/T通路密切相關。

rtI233V是發生于rtN236T附近233位點上的一個突變，目前對該突變的功能意義知之甚少。之前有研究顯示，rtI233V也可能在HBV耐ADV中發揮一定作用[15]。然而，I233V通路與HBV耐ADV是否確切相關尚有待進一步證實。

1.4 A181V/T通路

如前所述，A181V/T通路與HBV對ADV耐藥發生相關。Zoulim等于2008年的一項研究也發現，181位點的突變在HBV對LAM和ADV耐藥發生中起重要作用[16]。Locarnini 在此基礎上進一步指出[17]，A181V/T通路為HBV對所有核苷(酸)類藥物耐藥共有的原發性通路?？梢姡珹181V/T通路是一條非特異的通路。

1.5 其他耐藥通路

除上述幾條主要耐藥通路外，V84M/S85A、A194T、V214A/Q215S、P237H、N238D、I169T、T184G/S、S202I、M250V等通路也相繼報道，這些通路大多為繼發性耐藥通路。其中，V84M/S85A、P237H和N238D通路被認為與HBV耐ADV的發生相關， A194T通路與HBV耐TDF的發生相關，T184G、S202I和M250V通路與HBV耐ETV的發生相關，I169T、T184S通路與HBV對LAM和ETV的交叉耐藥相關，V214A/Q215S通路則與HBV對LAM和ADV的交叉耐藥相關[18]。但關于這些通路的具體臨床意義，目前認識仍不多。

1.6 對耐藥通路的綜合認識

Locarnini于2008年綜合了現有HBV耐藥通道研究成果，將HBV主要耐藥通路總結為五大類[17]：M204I/V、N236T、A181V/T、A181V/T+N236T和L180M+M204I/V±I169T±T184G±S202I±M250V。他進一步指出，M204I/V是HBV對L-核苷(酸)類藥物的主要耐藥通路；N236T是HBV對ADV耐藥的主要通路；A181V/T通路是HBV對所有核苷(酸)類藥物耐藥共有的原發性通路，為重要的交叉耐藥通路，且HBV僅對ETV敏感；HBV對ADV和TDF可通過A181V/T和N236T雙重通路發生耐藥；HBV可通過僅包含多重耐藥位點置換的L180M+M204I/V±I169T±T184G±S202I±M250V通路對ETV耐藥[7]。

對耐藥通路的新認識為臨床合理選用高基因屏障抗病毒藥物、預防HBV交叉耐藥的發生提供了重要指導意義。

2 對核苷(酸)類藥物耐藥的分子機制研究

除上述對HBV耐藥通路的認識外，有關耐藥發生的分子機制也有較多研究報道。HBV DNA聚合酶同源反轉錄酶三維立體分子模型的構建為闡明這些過程的分子機制提供了很多參考。

2.1 對L-核苷(酸)類藥物耐藥的分子機制

分子模型研究表明，發生rtM204I/V突變后，HBV DNA聚合酶上結合dNTP的袋狀結構的大小及電荷分布均發生改變， LAM與聚合酶間的空間阻力和靜電斥力增加，導致兩者結合能力下降，最終導致對LAM耐藥；發生rtL180M突變后，HBV DNA聚合酶與三磷酸拉米夫定氧硫雜環的親和力降低，增加該酶脫氧核糖結合位點的局部負電荷，使其對LAM與dCTP的鑒別力增強，保證了DNA復制的可靠性；而位于HBV反轉錄活性中心附近模板鏈上的173位點發生rtV173L突變后，聚合酶的聚合效率因復制模板和(或)催化中心結構發生調整而增強[4,19-21]。

上述研究從分子水平揭示了rtM204I/V、rtL180M及rtV173L突變如何在HBV對LAM耐藥發生中起作用。需指出的是，這些研究目前都主要集中在HBV對LAM耐藥分子機制的研究，對其他L-核苷(酸)類藥物如LdT的類似研究少有報道。但目前已有科學家基于活體內HBV對LAM耐藥也會對其他L-核苷(酸)類藥物產生高水平的交叉耐藥，以及對其他L-核苷(酸)類藥物耐藥由rtM204I/V引起這2個現象，提出HBV對其他L-核苷(酸)類藥物的耐藥機制可能與LAM相類似的假設[22]，這有待進一步研究驗證。

2.2 對無環磷酸鹽類藥物耐藥的分子機制

在研究ADV耐藥的分子模型中發現，野毒株聚合酶N236在D區可以與rtS85及ADV的γ-磷酸基團各形成1個氫鍵，使ADV發揮抑制病毒復制的效應。而發生rtN236T突變后，這2個氫鍵受破壞， ADV與聚合酶間的靜電作用力大大減弱，以致聚合酶對ADV的敏感度顯著降低，使HBV對ADV耐藥。rtA181V/T突變則可通過B區活性中心外的變構效應引起催化部位構象改變，達到類似效果[16]。這些研究進一步指出，空間上與rtN236T鄰近的rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A等突變位點也可能以類似方式在HBV對ADV耐藥發生中起作用。HBV對TDF耐藥的分子模型研究表明，rtA194T可通過變構效應影響復制模板與dNTP的結合而導致HBV對TDF耐藥[23]。

雖然上述機制能解釋聚合酶發生相應改變的HBV對ADV耐藥的原因，但在ADV治療失敗的患者中只有少數檢測到聚合酶的相應改變[24]，提示尚存在其他HBV耐ADV分子機制。

2.3 對環戊烷/烯類藥物耐藥的分子機制

環戊烷/烯類藥物的主要代表為ETV，但由于其具有高耐藥基因屏障的特點[7]，往往需有L180M、M204I/V、I169T、T184G、S202I、M250V等多個突變位點協同發揮作用，才導致HBV對ETV的最終耐藥，故這方面的分子模型研究相對于前2類藥物來說，顯得更為困難。目前為數不多的有關HBV耐ETV分子模型研究表明，169位點和250位點的突變可能主要通過影響反轉錄酶的引物結合區，促進引物與模板更緊密結合而發揮作用；184位點和202位點的突變則可能通過影響模板結合區域的α螺旋和C區催化天冬氨酸殘基的β片層之間的疏水區，進而增強M204I/V突變而發揮作用[25]。

3 HBV基因型與耐藥模式

目前已發現，HBV有A～J共10個基因型，我國以基因型B、C為主，歐美則以基因型A、D為主[26,27]。對基因型差異對HBV耐藥的影響，近年來開展了一系列的研究，將為今后針對不同人群采取個性化的耐藥防治措施提供重要依據。

Wiegand等于2008年研究指出，HBV基因型與干擾素治療療效相關，但HBV基因型與核苷(酸)類藥物的抗病毒療效是否相關，尚證據不足[28]。

Locarnini等于2010年的研究成果表明，基因型分布不同可通過影響耐藥通路而影響核苷(酸)類藥物的抗病毒療效[29]。該研究結果顯示，基因型A主要通過M204V通路發生HBV耐LAM，而基因型B、C、D則主要通過M204I通路發生HBV耐LAM；基因型C主要通過A181T通路發生HBV耐ADV，而基因型D則通過A181V通路發生HBV耐ADV。這一研究說明，不同基因型HBV發生各種耐藥性突變的頻率并不一致?；蛐头植际欠褚才cHBV對ETV及LdT等不同耐藥突變的發生頻率相關，尚缺乏相關研究資料。

有研究表明，rtM204I/V與rtL180M之間有密切關聯[9-11]，Locarnini等[29]對2003～2009年報道的具有不同HBV基因型的262例患者進行rtM204I/V與rtL180M關聯性分析。結果發現，基因型A、B、D患者中rtL180M與rtM204I關聯的頻率較基因型C患者小，而rtL180M與rtM204V關聯的頻率則正好相反，提示HBV基因型對rtM204I/V與rtL180M的關聯性有影響。

4 HBV耐藥預防新觀念

HBV雖為DNA病毒，其復制卻與RNA病毒的反轉錄復制極其相似。由于該復制極不穩定，所以容易導致耐藥突變的產生，包括自然產生和藥物誘導產生[18]。HBV耐藥的發生實際上是宿主、HBV、藥物三者之間相互作用的結果。按照基因屏障學說，僅單位點突變導致的耐藥往往比多位點突變導致的耐藥更易發生，即HBV對高基因屏障藥物往往不易發生耐藥。按照藥代動力學屏障學說[30]，若某種藥物對野毒株和耐藥株的復制均具很強的抑制作用，病毒復制就可維持于較低水平，產生耐藥的可能性很小，即早期抑制病毒復制能力越強的藥物，后續治療時對其發生耐藥的可能性越小。抑制病毒作用越強、越快，對其產生耐藥的可能性越小。

以往人們對HBV耐藥的認識主要停留于“無復制等于無耐藥”，過于強調抑制病毒復制的層面。但最近研究發現，由于HBV基因組結構中S區完全位于P區內，DNA聚合酶的相關耐藥突變常同時導致HBV表面抗原、抗體結合域發生重要結構改變，其中包括抗病毒藥物相關的潛在疫苗逃避突變(antiviral drug-associated potential vaccine escape mutant，ADAPVEM)。這一突變的產生導致疫苗誘導機體產生的抗體無法執行中和病毒的功能，從而可能對目前開展全球乙型肝炎免疫接種計劃帶來巨大挑戰。因此，HBV耐藥的預防不僅要求采取有效抑制病毒復制的措施，還應做到防止ADAPVEM的出現[31,32]。

5 結語

目前，關于CHB治療中HBV對核苷(酸)類似物的耐藥機制，臨床與基礎研究在分子和基因水平上解釋了許多相關現象，但許多認識仍很初步，機體免疫機制在HBV耐藥中的作用尚不明確，包括未發現耐藥相關基因突變但臨床治療療效應答不佳的原因。隨著研究不斷深入，人們將更全面認識HBV耐藥的發生過程，從而針對性地進行耐藥預防和干預，提高療效，改善患者的預后。

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