苦豆子種質資源遺傳多樣性的RAPD分析

陽 翠，張曉崗，楊玉蓉，劉 萍

(寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021)

苦豆子(Sophoraalopecuroides)系豆科槐屬植物，別名為苦豆根、苦豆草、苦干草，是我國西北干旱、荒漠地區廣泛分布的一種多年生草本植物[1]。由于苦豆子耐旱、耐寒、耐鹽堿，在荒漠和沙性土壤上具有極強的生命力，在黃河兩岸常栽培以固定沙土，是北方地區生態系統中重要的生態草[2]。其植株和種子富含多種生物堿、黃酮類物質、有機酸、氨基酸、蛋白質和多糖類等，具有抗癌、免疫等藥理活性[3]。目前，關于苦豆子的研究多集中在生物特性、化學成分、藥理作用和臨床研究等方面[4-6]，而關于其遺傳結構和遺傳多樣性方面的研究相對較少。

隨機擴增多態性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)是以PCR為基礎的簡單、快速的分子標記技術，該技術靈敏度高、操作簡單、實驗材料需要量少且要求不高、不需要放射性標記，適用于對種群的遺傳背景了解不多或根本不了解的物種，是植物DNA水平上遺傳多樣性的直接反映。RAPD分子標記技術現已廣泛應用于種質資源鑒定、親緣關系研究、遺傳圖譜構建及遺傳多樣性評價等領域[7-10]。本研究采用RAPD標記技術，對22個苦豆子居群進行比較分析，旨在從DNA分子水平上探索苦豆子居群間的遺傳多樣性程度，從而為苦豆子種質資源的保護以及引種栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1苦豆子種質資源 依據苦豆子的地理分布特點，分別采集來自寧夏、甘肅、青海、新疆、內蒙古5個省份22個居群的苦豆子種子作為供試材料，其中寧夏居群14個，其他省份的居群8個。在采集材料的同時進行生態環境的調查[6]，所有種子均于2007、2008年收集，保存于-70 ℃的超低溫冰箱中備用。居群編號、來源以及采集地的生態環境和伴生種如表1所示。

1.1.2試劑與儀器設備 用于RAPD反應的dNTP、Taq酶、Mg2+購自生工(上海)生物工程有限公司；引物由北京奧科生物公司合成；PTC-200型PCR循環儀購自美國伯樂公司；DYY-6B型穩壓穩流電泳儀、DYCP-31F型電泳槽、UV-VIA型紫外反射透射儀均購自北京六一儀器廠；Gilson微量移液器。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采用改良的CTAB法提取基因組DNA[11]。

1.2.2RAPD的反應程序和體系 RAPD擴增反應程序：94 ℃預變性120 s；94 ℃變性 20 s，36 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，39個循環；最后72 ℃延伸10min，擴增產物在0.5×TBE、電壓4～5 V·cm-1、2.0%瓊脂糖凝膠(含50 μg·mL-1溴化乙錠)中電泳，在紫外反射透射儀下觀察并用數碼相機拍照。RAPD擴增反應體系經過比較和優化確定為20 μL，具體如下：10×PCR buffer 2 μL，MgCl25 mmol·L-1，引物20 μmol·L-1，模板DNA 20 ng，dNTP 1 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶1 U·μL-1，ddH2O 12.5 μL。

表1 供試苦豆子種質資源編號、來源及生境調查Table 1 Germplasm resources and habitat characteristics of Sophora alopecuroides

1.2.3引物篩選 以103、106居群DNA為模板對300條RAPD隨機引物逐一進行篩選。記錄條帶清晰、有多態性的引物編號，將該引物再重復一次，驗證其可靠性，如果能夠清晰、穩定重復出現多態性，記錄引物編號，以備用于22個居群的遺傳多態性分析。

1.2.4數據統計與分析 根據PCR擴增產物的電泳結果按帶的有(記為1)無(記為0)建立二元數據矩陣。通過Popgene 32軟件計算下列參數：多態性位點百分比、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)、Shannon信息指數(I)、Nei’s遺傳距離(GSij)和遺傳相似性(GDij)。

GSij=2Nij/(Ni+Nj)；GDij=1-GSij.

式中，Nij為2個居群i和j共有的條帶數，Ni、Nj分別為第i個居群和第j個居群各自的條帶數[12]。

用NTSYS 2.1軟件并根據Nei’s遺傳距離用非加權配對類平均法(Unweight pair-group method with arithmetic means，UPGMA)進行聚類分析，構建各居群之間親緣關系樹狀圖；用DCENTER程序進行遺傳距離矩陣轉換，并用EIGEN程序求特征值和特征向量進行主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

2 結果與分析

2.1RAPD擴增結果 從300條RAPD隨機引物中篩選出31條帶型清晰、多態性好的引物，對22個苦豆子居群的DNA進行擴增。所有樣品均得到分子量在250～2 000 bp范圍內的條帶(圖1)。每個引物擴增的位點數為5～18個，共擴增出314個位點，平均每個引物的擴增位點數為10.13，多態性位點數為285個，多態性比率高達90.76%，多態位點百分率在60%～100%(表2)，說明所研究的22個居群苦豆子在DNA水平上遺傳多樣性較高。不同引物擴增的位點數不同，同一引物對不同居群苦豆子擴增的位點數也不一樣，充分體現出不同苦豆子基因組DNA的多態性，也表明苦豆子居群間存在遺傳差異。

2.2基于RAPD標記的遺傳多樣性聚類分析 為確定各苦豆子居群間的遺傳關系，通過Pop-gene 32軟件分析RAPD標記的(0，1)矩陣二元數據，計算出苦豆子居群水平上的Na、Ne、H、I分別為1.898 4、1.492 7、0.301 5和0.453 1，表明22個苦豆子居群間有一定的遺傳分化。

圖1 引物09M27519(A)和09M27532(B)對22個苦豆子居群的擴增結果Fig.1 The amplified result of primer 09M27519(A) and 09M27532(B) in 22 populations of S.alopecuroides

表2 苦豆子居群遺傳分析的RAPD引物及其擴增結果Table 2 The sequence of RAPD primers and polymorphic efficiency in 22 populations of S.alopecuroides

22個苦豆子居群間的遺傳距離在0.114～0.709，平均為0.369。其中居群124與居群127的親緣關系最近，遺傳距離為0.114；而居群105與居群125的親緣關系最遠，遺傳距離為0.709(表3)。對22個苦豆子居群的遺傳距離進行配對分析，發現居群105的平均遺傳距離在22個居群中最大為0.527，表明居群105與其他21個居群的遺傳差異最大。

表3 22個苦豆子居群遺傳距離的配對分析Table 3 Pairwise analysis of Genetic distance among 22 populations of S.alopecuroides

UPGMA聚類結果顯示在遺傳距離0.278處可將22個苦豆子居群聚為六大類(圖2)。

第Ⅰ類和第IV類均各由一個居群(105和106)單獨聚為一類；第Ⅱ類全部由寧夏以外的居群組成，包括居群122、124、125、126和127；第Ⅲ類由4個寧夏居群組成，包括居群103、104、109和112，這一大類又分為2個亞類，居群103與居群104聚為一亞類；居群109與居群112聚為另一亞類；第V類由來自寧夏的居群114、115、116與來自青海的居群121、內蒙的居群123、新疆的居群128組成；第VI類：由5個寧夏居群組成，包括居群101、102、110、107和108。聚類結果顯示，居群105和居群106 與其他20個苦豆子居群在DNA水平上有較大差異。

圖2 22個苦豆子居群的UPGMA聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 22 populations of S.alopecuroides

2.3基于RAPD標記的主成分(PCA)分析 對RAPD標記的數據進行PAC分析的結果顯示，第1主成分解釋的變異為43.70%，第2主成分解釋的變異為20.41%，第3主成分解釋的變異為9.62%，3個主成分綜合解釋的變異為73.73%，能夠反映苦豆子居群間親緣關系的遠近。將第1、2主成分結合起來分析可將22個苦豆子居群分為六大類群(圖3)，主成分分析結果與UPGMA聚類結果一致。可見，地理分布上的遠近與苦豆子居群間遺傳上的差異沒有必然聯系。研究發現，各居群所處的生態環境、海拔高度、經緯度以及伴生種各不相同(表1)，居群間的遺傳差異可能與其所處的微環境的異質性所造成的變異有關。

圖3 22個苦豆子居群RAPD標記的二維主坐標圖Fig.3 The principal coordinate graph of RAPD among 22 populations of S.alopecuroides

3 討論

植物的遺傳多樣性水平與其生物學特性、生境以及起源進化密不可分，其中繁育系統、分布范圍、生活型以及花粉和種子傳播方式對其影響最大[13]。本研究表明，野生苦豆子居群的多態率為90.79%，Nei’s基因多樣性(H)、Shannon多樣性指數(I)分別為0.301 5和0.453 1，苦豆子居群間具有較高的遺傳多樣性。

遺傳變異的作用主要是由選擇、突變和基因流動等因素產生，空間距離并不一定能夠產生遺傳變異，彼此相距很近的群體即使存在頻繁的基因流動，在強有力的選擇作用下也可能使得群體間產生遺傳上的變異和分化[13]。22個苦豆子居群的主成分分析與UPGMA聚類分析的結果均顯示來自寧夏的14個居群分別被劃分在了5個不同類群中，就連來自寧夏鹽池縣的5個居群(101、104、105、112、114)也分別聚在了4個不同的類群中，而來自甘肅(124)、內蒙(122)、新疆(125～127)的居群卻被歸為一類，各居群間出現了一定程度的遺傳分化，地理分布上的遠近與居群間遺傳上的差異沒有必然聯系。這一結果與陳小勇和宋永昌[14]對黃山西部青岡(Cyclobalanopsisglauca)種群小地理范圍的遺傳分化研究及劉萍等[15]對胡盧巴(Trigonellafoenum-graecum)遺傳多樣性的研究結果基本一致。苦豆子主要進行無性繁殖兼種子繁殖[16]，種群間基因交流相對較少，不同居群間的遺傳差異可能與其所處的小生境的異質性所造成的變異有關，強有力的環境選擇有可能導致居群間產生遺傳變異和遺傳分化。

苦豆子居群間的差異與環境因素有關，但更大程度上由其遺傳因素決定，RAPD分析結果證明了這一點。研究苦豆子不同地理種源間的遺傳差異，對苦豆子精細成分的提取、利用、科學合理的馴化和栽培有一定的意義。

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