白三葉種質資源形態變異與地理起源的關系

李 州，彭 燕，張婧源，馬 嘯

（四川農業大學動物科技學院，四川 雅安625014）

白三葉（Trifoliumrepens）為豆科（Leguminosae）三葉草屬中具有重要農藝價值的多年生牧草，原產于歐洲、北非和亞洲西部，在溫帶及亞熱帶地區均有分布，是世界各地栽培利用最為廣泛的豆科牧草之一，尤以新西蘭、澳大利亞、歐洲西北部、北美東部等地區栽培面積最大，在我國東北、西北、西南及長江中下游等地均有栽培。白三葉生長適應性強，品質優良，適宜與多種禾草混播種植，刈割和耐牧特性好，在草地畜牧業生產中占據重要地位。近年來，由于白三葉的匍匐生長特性及突出的生物固氮能力，亦被廣泛應用于園林綠化、水土保持、培肥地力等，被農業部列為向全國推廣果園生草覆蓋技術的首選草種，在國內環境和生態建設中發揮著重要作用。

白三葉為天然異源四倍體植物，具自交不親和性。因此，在遺傳組成上具有高度雜和的特性，無論是種群內還是種群間皆具有豐富的遺傳變異，其形態特征可塑性較大［1］。此外，白三葉廣泛分布于世界各地，適應生境具有多元化特點［2］。種質資源收集與遺傳多樣性研究是品種改良和育種的基礎，因而，白三葉種質資源收集及包括形態多樣性在內的農藝性狀和遺傳多樣性一直受到國內外相關研究者的重視。為了改良新西蘭白三葉品種特性，Widdup等［3］從美國收集了98個白三葉居群，并初步評價其農藝性狀。Dzene等［4］從世界各地收集白三葉材料，以篩選優良白三葉種質改良本國現有品種。此外，美國、澳大利亞及歐洲各國都較系統地收集和研究了白三葉種質資源［5-9］，而我國對白三葉種質資源的收集及其遺傳多樣性報道相對較少。安曉珂［10］研究了新疆野生白三葉與三葉草屬其他種的遺傳多樣性及遺傳關系，何?。?1］初步評價了從國內外收集的62份白三葉種質資源的遺傳多樣性，吳海濤［12］評價了從俄羅斯引進的18份野生白三葉種質資源的生長適應性、飼用性和景觀坪用性，Xian等［13］對采自國內中部、西南和西北部的14個白三葉居群進行了形態特征和分子遺傳多樣性研究，切彩等［14］分析了新疆11份野生白三葉的形態變異，張婧源等［15］應用SRAP分子標記研究了原產于世界各地的41份白三葉種質的遺傳變異。本研究以收集到的源自29個國家的68份野生白三葉種質為試材，研究其主要形態特征變異，并分析不同起源地白三葉形態變異分化趨勢，以期為篩選出不同用途優良的白三葉種質及為白三葉核心資源庫的建立提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試材料源自29個國家，共計68份，材料編號及來源見表1。

1.2 觀測指標與方法 2008年8月取50粒白三葉種子于智能光照培養箱中催芽，幼苗在沙盤中培育1個月左右，2008年10月上旬將幼苗移栽至田間試驗地，試驗地位于四川洪雅陽平種牛場試驗區，小區面積1m×1m，每小區移栽10株，株間距10 cm，重復3次。于2009年白三葉開花期進行觀測，每小區觀測10株。株高（cm）為地面至植株頂部的自然高度；生殖枝高（cm）為地面至生殖枝頂部的自然高度；用數碼照相機拍下距匍匐莖末端倒數第3葉的中間小葉，并用Photoshop軟件分析小葉面積（cm2）；觀測每小區開花的花序數，開花后，連續觀測4周，取平均值得到單位面積花序數；每小區隨機取5個完全開放的花序，觀測其小花數，連續觀測4周，取平均值得每花序小花數。

表1 供試白三葉種質及來源Table 1 Serial number and origin of Trifolium repens accessions

續表1

1.3 數據分析和統計方法 采用Microsoft office Excel 2003對數據進行處理；用SPSS 11.0軟件按歐氏距離對數據進行聚類分析；用NTSYS-pc program計算遺傳相似性系數矩陣和地理距離矩陣，用Mantel test檢驗兩者的相關性。

2 結果與分析

2.1 供試白三葉種質形態變異 通過對68份白三葉種質資源的5個形態特征進行基本統計分析，結果表明（表2），不同材料之間存在很大差異，表現出明顯的形態多樣性。葉面積的變異最大，變異系數高達69.48%，其次是單位面積花序數和株高，變異系數分別為50.24%和44.30%，而生殖枝高度和每花序小花數變異較小，變異系數分別為19.90%和18.81%。

供試材料平均株高為12.29cm，最高為23.27 cm，最低僅為1.34cm，變異較大。生殖枝和株高相比，表現為3種情況，一是明顯高于株叢，二是比株叢稍高，三是低于株叢。生殖枝平均高度為18.04 cm，最高為27.36cm，最短為9.50cm，變異較小。葉片大小變異最大，葉面積最大為18.44cm2，最小為0.23cm2，平均值為6.98cm2。68份白三葉開花能力差異很大，單位面積花序數平均為26.95個·m-2，最多可達50.17個·m-2，最少僅為2.67個·m-2。每花序小花數的變異最小，平均值為65.75個，最多為87.64個，最少為36.00個。

2.2 形態特征與地理距離的相關性分析Mantel檢驗表明，白三葉形態變異受地理環境的影響（表3），綜合指標（包括株高、生殖枝高度、葉面積、單位面積花序數和每花序小花數5個指標）、株高、單位面積花序數、每花序小花數特征變化存在空間相關性，且綜合指標、單位面積花序數、每花序小花數達到極顯著水平（P＜0.01），株高達到顯著水平（P＜0.05），而生殖枝高度、葉面積相關性不顯著。

表2 白三葉種質形態特征及變異Table 2 Morphological characteristics and variations in Trifolium repens accession for test

續表2

表3 白三葉形態特征與地理距離相關性的Mantel檢驗Table 3 Mantel test between morphological characters and geographical distance of Trifolium repens

2.3 聚類分析 對供試材料形態特征按歐氏距離進行聚類分析的結果見圖1，不同材料可明顯地劃分為4個類群，不同類群形態特征值見表4。第1類群包括33份材料，除1份亞洲材料和3份非洲材料外，其余29份全部來自歐洲，植株高度和生殖枝高度分別為（13.37±3.49）cm、（18.38±1.91）cm，葉面積為（6.24±2.74）cm2，單位面積花序數和每花序小花數較多，分別為（36.33±5.90）個·m-2和（72.98±4.96）個，表現為植株較高，中到小葉型葉片，有性繁殖能力較強；第2類群包括15份材料，其中亞洲10份（東亞4份，中亞4份，南亞、西亞各1份），歐洲（南歐）5份，形態指標為植株和生殖枝最低矮，分別為（4.92±2.08）cm 和（15.52±3.80）cm，葉面積最小，為（1.81±1.09）cm2，單位面積花序數較少，每花序小花數最少，分別為（20.51±8.26）個·m-2、（49.29±9.98）個，此類白三葉表現為植株低矮、小葉型、有性繁殖能力較弱；第3類群包括17份材料，全部來自亞洲，其中，西亞12份，中亞3份，南亞2份，植株和生殖枝高度分別為（15.11±4.87）cm、（18.17±3.90）cm，葉片較大，面積為（11.37±4.44）cm2，單位面積花序數最少，而每花序小花數較少，分別為（10.48±5.97）個·m-2

和（62.71±7.62）個，表現為植株較高，葉片中到大葉型、有性繁殖能力較弱；第4類的3份材料，分別來自歐洲的德國、南歐的希臘和斯洛文尼亞，各形態指標均為最大值，株高、生殖枝高、葉面積、單位面積花序數和每花序小花數分別為（19.11±0.50）cm、（26.24±0.97）cm、（16.07±2.23）cm2、（49.25±0.83）個·m-2、（85.71±1.83）個，表現為植株高大、大葉型、有性繁殖能力強。

圖1 白三葉種質資源形態特征聚類圖Fig.1 Morphological clustering analysis of Trifolium repens accessions

表4 不同類群白三葉形態特征Table 4 Morphological characters of different groups for Trifolium repens accessions

3 討論與結論

3.1 白三葉分布生境特點 白三葉起源于歐洲地中海地區，由于動物遷移等，傳播至歐洲和西亞各地。目前，在年降水量大于750mm的溫帶地區都有分布［16］。本研究中，供試白三葉主要分布于東半球和北半球的中低緯度區域，尤以大于30°的中緯度和海拔1 000～2 000m的區域最為豐富。相關分析亦顯示，白三葉分布地的緯度與經度、緯度與海拔呈顯著負相關，而經度與海拔呈顯著正相關。由此可見，白三葉分布的地理環境與白三葉生態習性相吻合，即白三葉喜冷涼-溫暖的氣候條件。

3.2 白三葉形態變異與生長特性的關系 葉片大小是區分白三葉類群的重要特征。按葉片大小白三葉可分為小葉、中葉、大葉和拉丁諾4個類型［17］。本研究顯示，在白三葉形態變異中，葉片大小的變異最大。聚類形成的4個類群，葉片呈從小到大的梯度變化。除葉片外，白三葉株高和單位花序數的變異亦較大，這與Jahufer等［6］對澳大利亞的439份白三葉種質形態特征的研究結果相一致。株高比其他特征的變異相對較大，表明白三葉生長高度和開花特性的可塑性較大，易受環境的影響而發生變化。在本研究中，生殖枝高度和每花序小花數變異相對較小，這可能與植物繁殖特性主要受遺傳制約而相對保守有關。在研究的形態特征中，除葉面積與單位面積花序數外，其余形態特征兩兩之間呈顯著正相關（P＜0.05），即大葉型的白三葉植株高大，開花時生殖枝亦較高，每花序小花數多，有性生殖能力較強，而小葉型的白三葉則植株低矮，有性生殖能力較弱。Finne等［9］也有類似報道，即白三葉葉叢高度與小葉長度和干物質產量呈兩兩正相關，種子產量與葉叢高度呈正相關。

3.3 白三葉形態變異與地理起源關系 白三葉形態多樣性與分布生境的多元化有關18。本研究的Mantel相關分析表明，白三葉形態變化與地理環境之間存在顯著相關性。國外有關白三葉形態與分布生境相互關系的報道較多。沿地中海盆地，白三葉葉片的大小梯度與溫度和水分有關［18］。小葉型的主要見于北部地區，如英國，葉片較大的拉丁諾主要分布于意大利北部，而葉片更大的白三葉則出現在歐洲南部和地中海。就緯度和海拔而言，小葉白三葉主要分布于高緯度和高海拔地區，大葉白三葉則分布于南部和低海拔地區［17-18］。并與 Widdup等［3］報道的美國白三葉種質形態變異相一致，即白三葉葉片隨緯度和海拔升高而變小，低緯度和低海拔地區，葉片最大。本研究顯示，單位面積花序數、每花序小花數與地理距離呈極顯著相關性，株高與地理距離呈顯著相關性。

進一步的聚類結果顯示，源于歐洲和亞洲的大部分材料，分別聚為不同的中-小葉型和中-大葉型兩個類群，而其他兩個分別為3份源自歐洲的大葉型類群和5份源自歐洲的與10份源自亞洲的小葉型類群。即原產地不同的多種材料聚為不同的類群，表明白三葉形態變異與地理起源存在較密切的相關性，而少數分別起源于歐洲和亞洲的不同白三葉種質亦聚為相同的一類，從形態上看，屬于一個葉片最小的類群，且3份源自歐洲的葉片最大的材料單獨聚為一類。表明不同起源的白三葉亦出現相似的遺傳分化，原產歐洲的白三葉形態朝不同方向的進化趨勢明顯，可能與歐洲為白三葉起源中心，遺傳多樣性豐富有關。Widdup等［3］報道，由于各種選擇壓力，如夏季的高溫、病毒病害、蟲害以及基因漸滲，北美白三葉種質資源葉片具有朝小葉和中葉進化的趨勢。Gustine等［19］研究亦顯示，白三葉葉片大小變異很大，溫和的選擇壓力可能使他們朝不同的方向發展。

近年來，白三葉在我國作為牧草、生態草、園林植物等栽培應用增長迅速。然而，我國生產中應用的白三葉品種主要從國外進口，多數表現為對干旱、高溫的適應性差，病蟲害嚴重，因而產量低、持久性差，阻礙了白三葉生產潛力的發揮。大量研究表明，不同生境的白三葉種質具豐富的形態變異以及多樣化的生長和適應環境的特性［20-27］，且不同地理起源的白三葉種質保持著豐富的分子遺傳變異［28-32］。由此可見，在更廣泛的范圍內，不同生境條件下收集不同生態型的白三葉種質尤其是本土的種質，以選育和改良優良白三葉品種，滿足不斷增長的多元化生產需求具有重要意義。

［1］Voisey C R，White D W R，Wigley P J，etal.Release of transgenic white clover plants expressingBacillus thuringiensisgenes：An ecological perspective［J］.Biocontrol Science and Technology，1994，4：475-481.

［2］Caradus J R，Forde M B，Wewala S，etal.Description and classification of a white clover（TrifoliumrepensL.）germplasm collection from southwest Europe［J］.New Zealand Journal of Agricultural Research，1990，33：367-375.

［3］Widdup K H，Caradus J R，Green J，etal.White clover ecotype germplasm from the USA for development of New Zealand and overseas cultivars Grassland［J］.Research and Practice Series，1996，6：149-154.

［4］Dzene I，Jansons A，Jansone B，etal.The study of variability of agro-morphological characteristics of white clover accessions from other countries in Latvian climate conditions［J］.Agronomy Research（Special Issue III），2010，8：537-544.

［5］Gustine D L，Huff D R.Genetic variation within and among white clover populations from managed permanent pastures of the northeastern U.S［J］.Crop Science，1999，39：524-530.

［6］Jahufer M Z Z，Cooper M，Harch B D.Pattern analysis of the diversity of morphological plant attributes and herbage yield in a world collection of white clover（TrifoliumrepensL.）germplasm characterised in a summer moisture stress environment of Australia［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，1997，44：289-300.

［7］Paolo A，Rosemary P C，Flavio F，etal.Variation in cold tolerance and spring growth among Italian white clover populations［J］.Euphytica，2001，122：407-416.

［8］Negri V，Veronesi F.Possible role of natural populations of white clover for reclamation purposes in subhumid and humid Mediterranean environments［J］.Agronomie，1987，7：703-708.

［9］Finne M A，Rognli O A，Schjelderup I.Genetic variation in a Norwegian germplasm collection of white clover（TrifoliumrepensL.）［J］.Euphytica，2000，112：33-44.

［10］安曉珂.三葉草屬三種植物遺傳多樣性的RAPD分析［D］.北京：中國農業科學院草原研究所，2008.

［11］何俊.62份白三葉種質資源遺傳多樣性初步研究與評價［D］.貴州：貴州農業大學，2008.

［12］吳海濤.俄羅斯引進野生白三葉種質資源的價值評價［D］.江蘇：揚州大學，2009.

［13］Xian Z，Ying J Z，Rong Y，etal.Genetic variation of white clover（TrifoliumrepensL.）collections from China detected by morphological traits，RAPD and SSR African［J］.Journal of Biotechnology，2010，9（21）：3032-3041.

［14］切彩，李衛軍，朱昊.11份白三葉材料的形態特征及生長表現［J］.新疆農業科學，2010，47（1）：135-140.

［15］張婧源，彭燕，羅燕，等.不同產地白三葉種質遺傳多樣性 的 SRAP 分 析 ［J］.草 業 學 報，2010，19（5）：130-138.

［16］Lane L A，Ayres J F，Lovett J V.A review of the introduction and use of white clover（TrifoliumrepensL.）in Australia-significance for breeding objects［J］.Australia Journal of Experimental Agriculture，1997，37：831-839.

［17］Caradus J R，MacKay A C，Woodfield D R，etal.Classification of a world collection of white clover cultivars［J］.Euphytica，1989，42：183-196.

［18］Davies W E，Young N R.The characteristica of European，Mediterranean and other populations of white clover（TrifoliumrepensL.）［J］.Euphytica，1967，16：330-340.

［19］Gustine D L，Voigt E C，Brummer P W，etal.Genetic variation of RAPD markers for North American white clover collections and cultivars［J］.Crop Science，2002，42（2）：343-347.

［20］Campbell B D，Caradus J R，Hunt C L.Temperature responses and nuclear DNA amounts of seven white clover populations which differ in early spring growth rates［J］.New Zealand Journal of Agricultural Research，1999，42：9-17.

［21］Fraser J.Characteristics of naturalized populations of white clover（Trifoliumrepens）in Atlantic Canada［J］.Canadian Journal of Botany，1989，67：2297-2301.

［22］Caradus J R，Christie B R.Winter hardiness and artificial frost tolerance of white clover ecotypes and selected breeding lines［J］.Canadian Journal of Plant Science，1998，78：251-255.

［23］Van D B J，Black I K，Cousins G R，etal.Enhanced drought tolerance in white clover［J］.Proceedings of the New Zealand Gmssland Association，1993，55：97-101.

［24］Jahufer M Z Z，Cooper M，Lane L A.Variation among low rainfall white clover（TrifoliumrepensL.）accessions for morphological attributes and herbage yield［J］.Australian Journal of Experimental Agriculture，1995，35：1109-1116.

［25］Jahufer M Z Z，Cooper M，Brien L A.Genotypic variation for stolon and other morphological attributes of white clover（TrifoliumrepensL.）populations and their influence on herbage yield in the summer rainfall region of New South Wales［J］.Australian Journal of Agricultural Research，1994，45（3）：703-720.

［26］Lane L A，Ayres J F，Lovett J V，etal.Morphological characteristics and agronomic merit of white clover（TrifoliumrepensL.）poulations collected from northern New South Wales［J］.Australian Journal of Agricultural Research，2000，51：985-997.

［27］Caradus J R，Hay R J M，Woodfield D R.The positioning of white clover cultivars in New Zealand［J］.Grassland Research and Practice Series，1996，6：45-50.

［28］Jahufer M Z Z，Barrett B A，Griffith G S，etal.DNA fingerprinting and genetic relationships among white clover cultivars［J］.Proceedings of New Zealand Grassland Association，2003，65：163-169.

［29］K?lliker R，Jones E S，Jahufer M Z Z，etal.Bulked AFLP analysis for the assessment of genetic diversity in white clover（TrifoliumrepensL.）［J］.Euphytica，2001，121：305-315.

［30］K?lliker R，Jones E S，Drayton M C，etal.Development and characterisation of simple sequence repeat（SSR）markers for white clover（TrifoliumrepensL.）［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，102：416-424.

［31］George J M P，Dobrowolski E Z，Jong N O，etal.Assessment of genetic diversity in cultivars of white clover（TrifoliumrepenseL.）detected by SSR polymorphisms［J］.Genome，2006，49：919-930.

［32］Fernanda B，Miguel D A，Maria T S W.Molecular characterization of the USDA white clover（TrifoliumrepensL.）core collection by RAPD markers［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2006，53：1081-1087.