不同產(chǎn)地麥冬遺傳多樣性的SRAP分析

馬秀杰，王冠明，韓烈保，3

（1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所暨森林培育與保護省部共建實驗室，北京100083；2.鴻銘控股有限公司，北京100020；3.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025）

“麥冬”指以麥冬為名的百合科沿階草族（Ophiopogoneae）沿階草屬（Ophiopogon）和山麥冬屬（Liriope）植物，在我國廣泛分布，除華北、東北和西北外，其他各省（區(qū)、市）均有分布。麥冬具有潤肺清津、養(yǎng)陰清熱的功能，塊根可入藥。一些麥冬品種具有四季常綠、耐踐踏、耗水少、易繁殖等特點，被廣泛應(yīng)用于園林綠化。麥冬的抗逆性、生態(tài)效益、經(jīng)濟效益優(yōu)于其他冷季型和暖季型草坪草［1］。目前全國以麥冬為名的沿階草屬有18個種（變種），山麥冬屬植物共有8個種（變種）［2］。麥冬類植物的分類混亂，山麥冬屬和沿階草屬的劃分一直存在爭議［3］，如湖北麥冬（L.spicata）與山麥冬（L.spicata）未開花時形態(tài)較為相似，難以鑒別［4］。因而，對我國不同產(chǎn)地的麥冬進行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析具有重要意義。

近年來，我國有關(guān)麥冬遺傳多樣性和分子標記的研究已逐漸展開。吳弢等［5］采用RAPD技術(shù)對4種山麥冬屬植物進行了分類學(xué)研究，李風(fēng)濤和雷公藤［6］利用RAPD標記對福建省內(nèi)不同產(chǎn)地的短葶山麥冬（L.muscari）進行了種源研究。黃玉吉等［7］測定了7個不同產(chǎn)地麥冬（O.japonious）和山麥冬的rDNA-ITS序列。但上述研究選用的樣品相對較少，分布狹窄。鑒于此，本研究采用SRAP分子標記技術(shù)對來自全國不同產(chǎn)地的48份麥冬材料進行遺傳多樣性研究，分析麥冬種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為麥冬的鑒定、種質(zhì)資源篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 對采自全國不同地區(qū)的98份麥冬進行分株擴繁后，選取48份材料進行測試，其中野生種19個，栽培種29個（表1），野生種用 W標識，栽培種用C標識。

1.2 DNA的提取 取新鮮麥冬葉片，液氮研磨后采用改良的CTAB法分別提取其基因組DNA［8］。

1.3 引物篩選與PCR擴增 SRAP所用引物及序列參照Li和Quiros發(fā)表的文獻［9］，引物由上海生工生物有限公司合成（表2）。首先選取4個具有代表性的材料（杭麥冬、川麥冬、闊葉山麥冬、山麥冬）對64種引物組合進行篩選，獲得多態(tài)性好，且條帶清晰的11種引物進行擴增。擴增反應(yīng)總體系為25μL：模板DNA 50ng，TransTaq-T酶1.25U，10× TransTaq-T buffer 2.5 μL，dNTPs 0.2 mmol·L-1，上、下游引物各0.2μmol·L-1，加滅菌水至25μL。SRAP-PCR采用復(fù)性變溫法：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，35℃復(fù)性1min，72℃延伸10min，4℃條件下保存。

表1 供試材料及來源Table 1 Name and source of materials in this study

表2 本試驗所用引物組合Table 2 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理 對清晰、可重復(fù)的DNA條帶進行統(tǒng)計，在相同遷移位置上，將穩(wěn)定出現(xiàn)的有條帶的記為1，無帶的記為0，獲得0和1組成的原始矩陣。利用表型矩陣，統(tǒng)計SRAP擴增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)量。按照Nei-Li［10］相似系數(shù)的方法計算。

式中，X1、X2分別為成對比較的2個品種的擴增帶數(shù)，X1，2為共有帶數(shù)。

采用（Nei-Li）遺傳相似系數(shù)、UPGMA 法［11］進行聚類分析。數(shù)據(jù)處理采用DPSv 7.05軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地麥冬SRAP擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析 從64對引物組合中篩選出多態(tài)性好且條帶豐富的11對引物組合（表3），對48份麥冬種質(zhì)進行PCR擴增，共產(chǎn)生621條清晰條帶，平均每對引物組合產(chǎn)生56.45條多態(tài)性條帶。me3＋em7引物組合擴增最多，為88條，me7＋em3引物組合擴增出65條（圖1），me7＋em6擴增最少，為36條。多態(tài)性總條帶數(shù)目為621條，平均多態(tài)性比率（PPB）達到100%。說明供試麥冬具有很高的遺傳多樣性。

表3 11對引物組合的SRAP擴增結(jié)果Table 3 Amplified results of SRAP with 11pairs of primers

圖1 引物組合me7＋em3對48份麥冬的的擴增結(jié)果Fig.1 SRAP amplification profiles of 48Lilyturfs with primer combination me7＋em3

2.2 遺傳距離與遺傳相似性分析 48份供試麥冬材料的相似系數(shù)GS值為0.058 4～0.936 7，平均為0.497 5，變幅為0.878 3，遺傳距離GD為0.066 3～0.941 6，平均為0.504，變幅為0.875 3。來自江蘇沭陽的7號日本矮生沿階草與來自廣西南寧的9號麥冬遺傳距離最小，為0.066 3，說明兩者具有較近的親緣關(guān)系。來自云南西雙版納的44號高腳沿階草與來自四川三臺的1號川麥冬遺傳距離最大，為0.941 6，說明兩者親緣關(guān)系較遠。分析結(jié)果表明，供試材料之間遺傳相似度低，差異明顯。

2.3 不同產(chǎn)地麥冬種質(zhì)聚類分析 在遺傳距離0.81處可將供試材料分成六大類（圖2）。第Ⅰ類共13份材料，又可分為2個亞類。第1亞類供包括10個材料，主要為產(chǎn)地不同的麥冬，第2亞類有3個材料，全部為沿階草。第Ⅱ類19份材料，分屬麥冬（O.japonicus）、山麥冬（L.spicata）、闊葉山麥冬（L.platyphylla）、短葶山麥冬（L.muscari）、禾葉山麥冬（L.graminifolia）5個種。其中3、5、8號為麥冬，與其他材料遺傳距離較遠，優(yōu)先聚為一個亞類，27、28、29號闊葉山麥冬、30號金邊闊葉麥冬和31號短葶山麥冬麥冬5份材料聚為一個亞類。第Ⅲ類共12份材料，除40號外，其余皆為沿階草，云南材料占該類群的75%。第Ⅳ類僅一份材料，形態(tài)學(xué)上鑒定為矮小沿階草（O.bodinierivar.pygmaeus），23、24和25號聚為一類。第Ⅴ類為細葉銀邊沿階草（O.intermediuscv.Argenteo-marginatus）。第Ⅵ類包括兩個沿階草材料。

圖2 48份麥冬種質(zhì)遺傳距離分析聚類圖Fig.2 Dendrogram of 48Lilyturf accessions based on SRAP

3 討論

SRAP分子標記是由Li和Qurios［9］于2001年提出的一種新型的基于PCR的分子標記方法。SRAP技術(shù)具有簡便、快速，不需預(yù)知物種的序列信息等特點，在植物遺傳多樣性分析［12］和種質(zhì)鑒定［13］方面得到了廣泛應(yīng)用。近年來，SRAP開始應(yīng)用于結(jié)縷草（Zoysiajaponica）［14］、野牛草（Buchloedactyloides）［15］和狗牙根（Cynodondactylon）［16］等草坪草和牧草的遺傳多樣性分析。本試驗篩選出11對條帶清晰、可重復(fù)的引物，共擴增出621條譜帶，平均多態(tài)性比率為100%。SRAP分子標記中，種內(nèi)平均多態(tài)比率達90%以上的報道相對較少，多見于種間。劉曉宏［17］對31份漆樹（Toxicodendron vernicifluum）種質(zhì)進行SRAP分析，11對引物組合擴增條帶平均多態(tài)性比率為98.04%。劉建豐［18］對29份野生煙草（Nicotianatabacum）種質(zhì)進行SRAP-PCR擴增，18對引物組合擴增多態(tài)性比率達到100%。陶愛芬等［19］用23對引物組合對96份黃麻（Corchoruscapsularis）種質(zhì)資源進行SRAPPCR擴增，多態(tài)性比率也為100%。

本研究選用的麥冬類材料分屬麥冬屬和沿階草屬，分化明顯、多樣性突出，表型豐富。擴增結(jié)果表明，使用SRAP分子標記技術(shù)可以有效地對麥冬進行遺傳多樣性分析。余伯陽和徐國鈞［2］觀察了湖北麥冬與山麥冬兩種植物的塊根和葉的組織形態(tài)，發(fā)現(xiàn)兩者之間無明顯差異，因此認為湖北麥冬的分類學(xué)位置有待進一步研究。吳弢等［5］對4種麥冬進行RAPD遺傳多樣性分析后認為，湖北麥冬與山麥冬的相對遺傳距離大于山麥冬與闊葉山麥冬的相對遺傳距離，湖北麥冬和山麥冬應(yīng)該為兩個種。本研究采用SRAP分子技術(shù)對48種麥冬的遺傳多樣性分析顯示，14號湖北麥冬與來自不同產(chǎn)區(qū)的19、20、21和22號山麥冬可聚為一大類，但是相對遺傳距離大于同類中來自不同產(chǎn)區(qū)的26、27、28、29和30號麥冬，進一步支持了吳弢等［5］的觀點。31號短葶山麥冬與26、27、28、29和30號闊葉山麥冬可聚為一類，且遺傳距離非常小，這與徐炳聲和李林初［20］的闊葉山麥冬和短葶山麥冬無明顯界限，闊葉山麥冬為短葶山麥冬變種的觀點一致。

Wilson等［21］認為種質(zhì)的地理分布與分子標記間存在相關(guān)性，在苜蓿（Medicagosativa）22、狗牙根［23］、白三葉（Trifoliumrepens）［24］等草坪草和牧草上的遺傳分析也證實了來自相似地理環(huán)境的種質(zhì)可以優(yōu)先聚為一類。本研究通過對產(chǎn)地不同的麥冬進行SRAP統(tǒng)計分析和聚類分析，發(fā)現(xiàn)供試材料也呈現(xiàn)一定的地域分布規(guī)律。第Ⅰ類群來自四川的1和2號以及來自浙江的4和6號分別聚在一起，可能與它們起源以及分布相似性有關(guān)。第Ⅱ類群中，來自北京的3、15和16號生態(tài)環(huán)境相似，也可以聚在一起。第Ⅲ類群中，來自云南的32、34、35、36、38、41、42、43、46和47號沿階草材料可以聚為一類，這可能由于云南特有的海拔高度、土壤氣候及降雨對沿階草的自然選擇造成的影響，使得該地區(qū)材料基因型趨近一致。來自浙江慈溪的5號栽培種麥冬及6號野生種麥冬未能聚在一起，這可能是由人為選擇導(dǎo)致的。

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