白酒糟發(fā)酵菌種組合的篩選

郭素環(huán) 周碧君，2 文 明，2 程振濤，2 王開功，2 夏先林 吳 艷 李曉丹

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025）

我國每年白酒糟產(chǎn)量高達2100多萬噸，基于酒糟中含有一定的蛋白質(zhì)、豐富的氨基酸、維生素和多種微量元素等，傳統(tǒng)的做法是將鮮酒糟直接飼喂牲畜當飼料原料，此方法有兩個弊端：一是鮮酒糟內(nèi)粗纖維含量高、家畜適口性差、消化率低，霉爛酒糟易產(chǎn)生病害；二是鮮酒糟含水率高，難運輸，酸度高，易腐敗變質(zhì)。為此,人們對其資源化利用問題進行了多方面的研究,例如：利用白酒糟制取甘油[1-2],培養(yǎng)食用菌[3-5]，提取復合氨基酸及微量元素[6]，提取植酸和植酸鈣[7]，釀醋[8-9]等；利用酒精糟厭氧發(fā)酵回收沼氣[10-11]，提取蛋白質(zhì)[12],生產(chǎn)干全飼料(DDGS)[13]，制取單細胞蛋白(SCP)飼料[14]，酒糟發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇[15]，生產(chǎn)粗酶制劑[16]等。以上方法由于規(guī)模小、能源消耗大、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化不充分等問題多數(shù)處于停頓狀態(tài)。為此我們采用微生物固態(tài)發(fā)酵白酒糟生產(chǎn)生物飼料，此法有以下優(yōu)點：微生物生長速度快，周期短、蛋白質(zhì)含量高，含豐富的必需氨基酸、B族維生素、輔酶等，生產(chǎn)不受氣候條件，生產(chǎn)季節(jié)變化，僅需少量土地和勞力，酒糟中營養(yǎng)物質(zhì)得到有效的利用。此法的效益在生產(chǎn)上得到很好的驗證：日本大阪市的田金公司在酒糟內(nèi)加入部分乳酸菌，發(fā)酵后成為牛的“上等食品”。吃了這種飼料，牛就可以長出脂肪均勻的“五花上等肉”[17]。在國內(nèi)，蔡治華等[18]用微貯酒糟飼喂黑白花奶牛，經(jīng)過30 d的試驗，結(jié)果表明：添加微貯酒糟的試驗組比添加鮮酒糟的對照組奶牛的日均產(chǎn)乳量提高了4.43%,差異顯著，乳脂率提高了2.34%。

本試驗將班圖酒香酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉、嗜酸乳桿菌這4種菌進行不同組合發(fā)酵以鮮白酒糟、玉米粉及菜籽粕為基質(zhì)原料，觀察發(fā)酵前后成分的變化，為生產(chǎn)酒糟生物飼料選擇適合的菌種組合提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供實驗菌種

Y1嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、Y2班圖酒香酵母菌（Brettanomyces custersianus）、Y3綠色木霉（Trichoderma viride）和Y4枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn]均為貴州大學動物科學學院試驗室保存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

普通培養(yǎng)基：嗜酸乳桿菌培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基,班圖酒香酵母培養(yǎng)用YPD培養(yǎng)基,綠色木霉培養(yǎng)用綜合馬鈴薯培養(yǎng)基,枯草芽孢桿菌培養(yǎng)用普通肉湯培養(yǎng)基[19]。

酒糟飼料發(fā)酵培養(yǎng)基:鮮白酒糟60%、玉米粉10%、菜籽粕10%、水20%,另加硫酸亞鐵15 mg/100 g、硫酸鋅12 mg/100 g、硫酸錳 10 mg/100 g、硫酸銅 15 mg/100 g、磷酸氫鈣2 g/100 g，pH值6.0，121℃、0.1 MPa條件滅菌30 min。

鮮白酒糟：由貴州省青酒集團提供，玉米粉、菜籽粕于當?shù)刭徺I。

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗實驗

將班圖酒香酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉、嗜酸乳桿菌4種菌兩兩組合分組，將每組的其中1種菌以10 mm的間隔劃線接種于普通培養(yǎng)基上，然后取另外一種菌垂直劃一條直線，30℃培養(yǎng)24 h，觀察十字交叉處是否有被抑制而發(fā)生菌落萎縮和消失的現(xiàn)象。

1.2.2 酒糟微生物固態(tài)發(fā)酵

分別挑取Y1～Y44種菌純培養(yǎng)物，各接種一環(huán)于100 ml液體培養(yǎng)基中，150 r/min、30℃搖菌。搖菌后將4種菌以單菌、雙菌、三菌、四菌搭配分為14組每組3個重復，每個重復按相等比例，總接種量為6%[20]的比例接種到酒糟飼料發(fā)酵培養(yǎng)基中。綠色木霉接種搖菌后第36 h的,活菌數(shù)達到 7.00×1010cfu/ml、酵母菌接種搖菌后第32 h的,活菌數(shù)達到3.50×1011cfu/ml、乳酸菌接種搖菌后第16 h的,活菌數(shù)達到2.10×1010cfu/ml、枯草芽孢桿菌接種搖菌后第22 h的，活菌數(shù)達到1.33×1011cfu/ml。接種后以 1～4 d 有氧，5～10 d 為厭氧，發(fā)酵溫度均為30℃。具體分組為：第1組：對照組（發(fā)酵前的樣品，未接菌、未發(fā)酵）、第2組：單接Y1、第3組：單接 Y2、第4組：單接 Y3、第5組：單接 Y4、第6組：Y1+Y2、第7組：Y1+Y3、第8組：Y2+Y3、第9組：Y1+Y4、第10組：Y2+Y4、第11組：Y3+Y4、第12組：Y1+Y2+Y4、第13組：Y2+Y3+Y4、第14組：Y1+Y2+Y3、第15組：Y1+Y2+Y3+Y4。

1.2.3 營養(yǎng)成分的測定

酶活測定：發(fā)酵第7 d取樣采用ELISA試劑盒測定蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶活性濃度。

酒糟飼料發(fā)酵培養(yǎng)基各養(yǎng)分指標：將發(fā)酵前及發(fā)酵第10 d的飼料樣品混勻、烘干、粉碎制備成分析試樣。干物質(zhì)測定采用直接干燥法 (GB/T6435—2006)；馬福爐550℃高溫灼燒法(GB/T6438—2007)測定粗灰分；凱氏定氮法(GB/T6432—1994)測粗蛋白；中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量參照 Van Soest等[21]的方法測定；氨基酸含量按照GB/T5009.124—2003法采用日立835-50氨基酸分析儀測定；脂肪酸含量按照GB/T 9695.2—1988，采用日本島津GC-14C氣相色譜儀測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS9.21 GLM Duncan法對數(shù)據(jù)進行方差分析,顯著標準為0.05。統(tǒng)計結(jié)果均以平均值或平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗實驗結(jié)果

各組菌種十字交叉處均未出現(xiàn)菌落萎縮和消失的現(xiàn)象，得出結(jié)論各菌間均不存在拮抗效應，適合組合發(fā)酵酒糟培養(yǎng)基。

2.2 不同菌種組合酒糟生物飼料的酶活結(jié)果(見表1)

由表1可知，發(fā)酵第7 d與對照組相比各處理組蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶活性濃度都有增加，其中蛋白酶活性濃度為229.21～336.05 U/g，增率為 8.20%～58.60%，差異最顯著的為第2、7、15組（P＜0.05）；淀粉酶活性濃度為247.95～371.08 U/g，增率為2.5%～53.5%，與對照組相比差異最顯著的為第12組其次為第15組（P＜0.05）；脂肪酶活性濃度為89.93～158.89 U/g，增率為0.4%～77.4%，與對照組相比差異最顯著的為第3組（P＜0.05）；纖維素酶活性濃度為31.27～104.78 U/g，增率為4.6%～250.6%，與對照組相比差異最顯著的為第5組其次為第15組（P＜0.05）。從而可知在添加量一定的情況下添加一種或三種菌只能使其中一種酶活性濃度達最大，產(chǎn)酶不全面。綜合考慮4種酶的活性濃度，第15組的結(jié)果比較理想。4種菌一起添加不僅能使酶的分泌全面而且酶活濃度與單一添加相差很小。

2.3 不同菌種組合酒糟生物飼料的常規(guī)營養(yǎng)成分結(jié)果（見表 2）

由表2可知與對照組相比各處理組干物質(zhì)含量為92.92%～95.31%，增率為0.20%～2.80%，差異最顯著的是第15、13、10組(P＜0.05)，其中第15組含量達95.31%比對照組提高2.80%；與對照組相比各處理組粗蛋白含量為21.03%～23.20%,增率為36.80%～50.90%,差異最顯著的是第15組（P＜0.05），含量為23.20%比對照組提高50.90%；與對照組相比各處理組酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維降低率分別為23.70%～50.20%、16.80%～41.20%,差異最顯著的都是第15組(P＜0.05)分別比對照組降低了50.20%、41.20%；與對照組相比各處理組粗灰分含量為9.35%～11.15%增率為59.60%～90.30%，差異最顯著的是第15組（P＜0.05），含量達11.15%比對照組提高90.30%。綜合考慮以上5種常規(guī)成分，第15組的效果最理想。

表1 各組蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶酶活測定結(jié)果(U/g)

表2 發(fā)酵前后各組常規(guī)成分含量（%，風干基礎(chǔ)）

2.4 不同菌種組合酒糟生物飼料的脂肪酸含量（見表3）

由表3可知酒糟培養(yǎng)基料中含有較豐富的脂肪酸，主要含有17種脂肪酸，即飽和脂肪酸 7種，不飽和脂肪酸10種，其中單不飽和脂肪酸4種，多不飽和脂肪酸6種。與對照組相比第15組二十二碳六烯酸(DHA)的含量最高，比對照組提高11.50%。各處理組單不飽和脂肪酸之和為25.65%～26.87%，與對照組相比差異最顯著的為第7、8組（P＜0.05），分別比對照組提高1.50%、1.60%。各處理組多不飽和脂肪酸之和為30.85%～31.87%與對照組相比差異最顯著的為第12、15組（P＜0.05），比對照組提高 4.90%。從功能性脂肪酸和多不飽和脂肪含量出發(fā)綜合來看第15組要優(yōu)于其它組。

2.5 不同菌種組合酒糟生物飼料的氨基酸含量（見表4）

本實驗對酒糟混合料中的17種氨基酸進行了測定，即必需氨基酸9種，非必需氨基酸8種。由表4可知各處理組氨基酸總量為15.74%～19.18%，與對照組相比差異最顯著的為第8組（P＜0.05）含量達19.18%，其次為11、15組分別為18.65%、18.31%，各比對照組提高23.70%、20.30%、18.10%；必需氨基酸之和為6.81%～8.55%，與對照組相比差異最顯著的為第8組(P＜0.05)含量達8.55%,其次為11、15組分別為8.31%、8.15%，分別比對照組提高22.00%、18.50%、16.30%；鮮味氨基酸之和為6.59%～7.74%，與對照組相比差異最顯著的為第8組（P＜0.05），其次是第11、13、15組分別比對照組提高27.50%、22.20%、19.90%、19.80%。綜合考慮氨基酸總量、必需氨基酸總量和鮮味氨基酸總量，第8組效果最好其次是第11、15組。

表3 發(fā)酵前后各組脂肪酸含量（%）

表4 發(fā)酵前后各組氨基酸含量（%）

3 討論與結(jié)語

3.1 不同菌種組合對酒糟生物飼料酶活的影響

動物日糧中添加一定酶制劑可以補充動物內(nèi)源酶的不足，刺激內(nèi)源酶分泌提高動物對日糧的利用率。同時還可以改善消化道酶系組成、酶量及活性。高玉紅等(2000)[22]研究了復合酶(主要含酸性蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、纖維素酶及果膠酶)對斷奶仔豬飼料利用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復合酶可以提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，顯著提高飼料中干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的消化率，而且隨著酶活水平的提高，血漿葡萄糖含量也呈極顯著增加。本研究篩選出第15組（Y1+Y2+Y3+Y4組）效果最好，4種菌一起添加不僅能使酶的分泌更全面而且各酶活濃度都比較高，能在一定程度上補充動物所需的內(nèi)源酶。

3.2 不同菌種組合對酒糟生物飼料常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

采用能降解纖維素大量產(chǎn)生蛋白質(zhì)的菌株對酒糟進行發(fā)酵這既擴大了飼料來源又提高了資源利用率，本研究所做各處理組中第15組效果最明顯，干物質(zhì)達到95.31%比對照組提高2.80%。粗蛋白能達到23.20%比對照組提高50.90%。與對照組相比各處理組酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維都降低，效果最好的是第15組分別比對照組降低了50.20%、41.20%。粗灰分能達到11.15%比對照組提高90.30%。這既提高了飼料的營養(yǎng)價值又提高了飼料的適口性和利用率。

3.3 不同菌種組合對酒糟生物飼料脂肪酸含量的影響

豐富的不飽和脂肪酸含量是發(fā)酵飼料具有較高營養(yǎng)價值的物質(zhì)基礎(chǔ)[23]。本研究中各處理組都含有較豐富的脂肪酸，其中第15組二十二碳六烯酸(DHA)的含量最高，比對照組提高11.50%。多不飽和脂肪酸之和與對照組相比差異最顯著的為第12、15組(P＜0.05)，都比對照組提高4.90%。綜合來看第15組要優(yōu)于其它組。

3.4 不同菌種組合對酒糟生物飼料氨基酸含量的影響

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，而動物對蛋白質(zhì)的需求本質(zhì)上是對氨基酸的需求，因此飼料中氨基酸的種類和含量是衡量其質(zhì)量高低的一項重要指標。本實驗對酒糟混合料中的17種氨基酸進行了測定，發(fā)現(xiàn)與對照組相比各處理組含氮物質(zhì)的形式發(fā)生了變化，主要表現(xiàn)為氨基酸總量和必需氨基酸總量、鮮味氨基酸總量的增加這與Weinberg Z G（1993）[24]的研究結(jié)果相符合。氨基酸總量為第8組最高達19.18%其次為11、15組分別為18.65%、18.31%；必需氨基酸之和為第8組含量最高達8.55%其次為11、15組分別為8.31%、8.15%；鮮味氨基酸之和為第8組最高，其次是第11、13、15組。綜合來看第8組效果最理想，其次是第11、15組。

綜合考慮以上四個因素最終篩選出第15組為最佳菌種組合，也就是所選4種菌以相等比例一起添加。從而也證明這4種菌相互間有協(xié)同的作用，聯(lián)合添加發(fā)酵白酒糟能達到更好的效果。

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