瑞舒伐他汀對肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡影響的實驗研究▲

黃維佳 覃家錦 何 巍 戴 霞 馮 旭 郭建極 冼 磊

(1廣西柳州市人民醫院心胸外科，柳州市 545001;2廣西醫科大學第一附屬醫院心胸外科，南寧市 530021)

近年來，他汀類降脂藥物的“非調脂作用”引起了學者們的關注［1］，其中他汀類藥物拮抗及逆轉肺動脈高壓的作用是目前研究的熱點。瑞舒伐他汀是新近合成的新一代羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，其對于肺動脈高壓的作用報道尚少，更未見到其對于左向右分流肺動脈高壓影響的研究。本文通過左向右分流肺動脈高壓大鼠模型，觀察瑞舒伐他汀干預后模型大鼠肺組織中肺動脈平滑肌細胞凋亡的變化及bcl-2蛋白表達的情況，初步探討瑞舒伐他汀對左向右分流肺動脈高壓的影響及其可能機制，為今后臨床使用瑞舒伐他汀治療先心病繼發的肺動脈高壓提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD大鼠(廣西醫科大學實驗動物中心提供)，瑞舒伐他汀鈣片(英國阿斯利康制藥有限公司)，多通道生理記錄儀(RM-6000，日本)，雙目顯微鏡(Olympus，日本)，電泳儀(Bio-Rad公司，美國)，Q550CW計算機圖像分析系統(Leica公司，德國)。

1.2 實驗分組 隨機將36只SD大鼠分為3組(每組12只)。①分流給藥組:于分流手術第2天開始予瑞舒伐他汀(10 mg/kg)灌胃，每天1次，連續給藥11周;②分流組:于分流手術第二天開始予等體積0.9%生理鹽水灌胃，每天1次，連續給藥11周;③對照組:常規開腹但不做分流，手術后第二天開始予等體積0.9%生理鹽水灌胃，每天1次，連續給藥11周。

1.3 建模方法 對大鼠行腹腔內注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉，手術切口選取腹部正中切口，鈍性游離后腹膜，暴露腹主動脈及下腔靜脈，在腹主動脈的左腎動脈開口下方及髂總動脈上方，分別用小動脈夾夾閉，于腹主動脈左側壁用尖刀片挑開1 mm切口，用20 G套管針以45度角穿透腹主動脈壁進入鄰近的下腔靜脈內，原則上不能刺破下腔靜脈對側管壁，反復穿刺后拔出針頭，用7-0滑線縫合腹主動脈壁的切口，移走小動脈夾，此時可觀察到大鼠下腔靜脈變粗，出現微弱搏動，或顏色由暗變紅，均提示分流已形成。

1.4 平均肺動脈壓(mPAP)及右心室肥厚指數(RVI)測定

經腹腔內注射戊巴比妥鈉麻醉，游離右頸外靜脈，將聚乙烯導管經右頸外靜脈插入大鼠肺動脈，導管另一端接壓力換能器及多通道生理記錄儀，記錄mPAP。于大鼠心臟大血管根部切斷，取出心臟后分離右室游離壁(RV)、室間隔(S)及左室壁(LV)并分別稱重，通過公式RVI=［RV/(LV+ S)］計算右心室肥厚指數。

1.5 HE染色 4%多聚甲醛固定大鼠肺組織，常規石蠟包埋、切片、HE染色。應用Olympus雙目顯微鏡觀察，每只大鼠隨機選取一張切片，每張切片中隨機選擇肺小動脈15條，通過Q550CW計算機圖像分析系統進行血管形態計量，測量平均血管總面積(TA)、血管腔面積(IA)、管壁厚度(WT)、血管外徑(ED)，通過公式WT%=(2×WT/ED)× 100%及WA%=(TA－IA)/TA×100%計算出管壁厚度占外徑的百分比(WT%)、管壁面積占血管總面積的百分比(WA%)，以反映肺血管重構的程度。

1.6 大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡的檢測 采用細胞凋亡原位缺口末端標記法(TUNEL)對切片進行染色，按凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。計算隨機10個高倍視野(×400)中凋亡陽性肺動脈平滑肌細胞數與其平滑肌細胞總數的比值(凋亡指數apoptotic index)，求其平均值。

1.7 大鼠肺組織中bcl-2蛋白的Western blot檢測 100 mg大鼠肺組織提取總蛋白，考馬斯亮藍法進行蛋白定量，蛋白樣品與上樣緩沖液混合后于100℃下煮沸5 min。將樣品放在10%的SDS-聚丙烯凝膠中進行電泳，后轉印至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入 bcl-2抗體(1∶800)及β-actin抗體(1∶10 000)，并常溫下過夜。洗膜3次后加入二抗并作用1 h，按ECL說明書操作進行顯色，將膠片圖像輸入Q550CW計算機圖像分析系統進行表達強度測定，以目的蛋白與β-actin的IOD值之比表示目的蛋白表達的相對水平。

1.8 統計學方法 統計學分析采用SPSS 13.0軟件，實驗數據均以mean士SD表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為標準表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠平均肺動脈壓力及右心室肥厚指數的變化 分流給藥組大鼠平均肺動脈壓要明顯低于分流組，分別為(22.8±3.7)mmHg、(31.2±5.5)mmHg;同時，分流給藥組大鼠右心室肥厚指數也明顯低于分流組，分別為(38.5±6.4)%、(49.2±6.8)%。上述兩組間指標的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 HE染色顯示肺小動脈形態的變化 經過11周的干預，分流組、分流給藥組大鼠肺小動脈管壁厚度占血管外徑百分比(WT%)分別為(35.3±4.1)%、(20.7±3.2)%，肺小動脈管壁面積占血管總面積百分比(WA%)分別為(51.2±3.3)%、(31.6±3.9)%，分流給藥組大鼠肺小動脈壁增厚、血管壁平滑肌細胞肥大增生、管壁面積增加、管腔狹窄等情況較分流組輕，肺血管重構有明顯改善，上述兩組間指標的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠mPAP、RVI、WT%及WA%的變化

2.3 大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡的變化 光鏡下(×400)觀察TUNEL染色切片，凋亡的肺動脈平滑肌細胞核被染成棕黃色。見圖1。對照組、分流給藥組、分流組大鼠肺組織中TUNEL陽性細胞百分比(AI)分別是17.21±1.23、9.98±1.36、5.38±1.09，其中分流給藥組大鼠AI值要大于分流組，表明分流給藥組大鼠肺動脈平滑肌凋亡的細胞較分流組多，各組間的差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 大鼠肺組織中bcl-2蛋白表達 對照組、分流給藥組、分流組大鼠肺組織中 bcl-2蛋白的表達水平依次是1.19±0.12、1.52±0.47、2.27±0.56。可以看出，經過瑞舒伐他汀干預能降低bcl-2蛋白的表達水平，各組間的變化差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠光鏡下TUNEL染色切片

3 討論

先天性心臟病繼發的肺動脈高壓發病機制復雜，目前尚未完全明確，如果不進行積極干預，絕大多數病例將發展為艾森曼格綜合征，最終導致右心衰竭而死亡。目前可選擇的治療方法不多，如吸氧、抗凝劑、血管擴張劑等治療效果有限，病程晚期只能考慮肺移植或心肺聯合移植。近年來，新型血管擴張劑如血管緊張素受體拮抗劑纈沙坦、磷酸二酯酶5(PDE5)和抑制劑西地那非以及內皮素受體拮抗劑波生坦相繼問世，給肺動脈高壓的藥物治療帶來希望［2］。但國外隨機前瞻性研究發現，這些藥物雖然可以不同程度降低肺動脈壓力、緩解患者癥狀，但不能明顯改善肺動脈高壓病人的生存率，不能逆轉病變的進程，而且存在明顯副作用，使患者對這些藥物的依從性較差，因此迫切需要尋找新的替代藥物。

他汀類藥物屬于 3-羥基、3-甲基戊二酰輔酶 A (HMG-CoA)還原酶抑制劑，目前臨床上廣泛應用于降低膽固醇的治療。最近大量的研究發現，他汀類藥物除了抗脂質生成作用外，還有許多非調脂藥理作用，當中預防和逆轉肺動脈高壓是目前學者們的研究熱點。研究表明，他汀類藥物能有效治療肺動脈高壓，可能與其誘導肺動脈平滑肌細胞或血管內皮細胞凋亡、抑制靶細胞增殖有關。Knapp等［3］研究發現，脂溶性他汀藥物可誘導平滑肌細胞凋亡，這種效應能被HMG-CoA還原產物羥甲戊酸所阻斷。體外實驗發現他汀類藥物通過促進凋亡相關蛋白Rac1 GG化，增強Rac1的表達，能明顯促進肺靜脈內皮細胞凋亡［4］。Toshihikl等［5］研究發現，與非脂溶性他汀類藥物不同，脂溶性他汀類藥物可以下調bcl-2基因表達，使Rho激酶異戊化，從而參與血管平滑肌細胞凋亡。此外，研究發現抑制rho-激酶、CDK4和CDK2激酶活性，調節細胞周期也可能是他汀類藥物抗增殖和促凋亡的機制［6，7］。

瑞舒伐他汀是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑家族中的新成員，屬于氨基嘧啶衍生物，分子結構為單一對映異構羥酸鈣鹽，二羥基庚烯酸是分子中的共性藥效基團。另外，瑞舒伐他汀結構中的甲基磺酰胺基團使整個分子具備低親脂性［8］，極易被肝細胞攝取，避免被肝細胞中細胞色素P450酶大量降解［9］，以上藥理特點使瑞舒伐他汀比同類藥物更具有優勢，比如對HMG-CoA還原酶更強大的抑制作用，更長的藥物半衰期，更好的肝選擇性，更少的藥物交叉反應，患者有更好的藥物耐受性。目前由于瑞舒伐他汀剛上市不久，其對于肺動脈高壓相關影響的報道少見，更未見到他對于肺高血流性肺動脈高壓相關作用的研究，也不清楚在肺高血流性肺動脈高壓中瑞舒伐他汀的作用是否與相關靶細胞凋亡有關。本研究發現，分流給藥組mPAP、WT%、WA%、RVHI值明顯低于分流組，說明經過瑞舒伐他汀干預，肺高血流模型大鼠肺動脈壓力和肺血管重構能得到有效緩解，大鼠右室幾何構型的改變也得到抑制。同時，分流給藥組 bcl-2蛋白的表達明顯低于分流組，TUNEL陽性細胞百分比(AI值)明顯高于分流組，凋亡的肺動脈平滑肌細胞數量明顯上升，說明瑞舒伐他汀緩解肺血管重構可能是通過某些信號途徑抑制了凋亡抑制基因的表達，從而促進肺動脈平滑肌細胞凋亡。結合以往的研究結論，我們推測:瑞舒伐他汀可能通過相關細胞信號途徑下調凋亡相關蛋白如bcl-2的表達，促進肺動脈平滑肌細胞凋亡，從而參與拮抗肺高血流性肺血管重構的過程。

總之，瑞舒伐他汀促進肺動脈平滑肌細胞凋亡是其拮抗肺高血流性肺血管重構的重要機制之一。本文初步探討了瑞舒伐他汀治療肺動脈高壓的可能機理，但其復雜的信號轉導途徑和調控機制需要基礎實驗進一步闡明，以及該藥物是否能真正用于臨床也需要大量臨床實驗的深入開展。

圖2 各組大鼠bcl-2蛋白水平的變化

［1］ 邢西遷，甘 燁，吳尚潔.他汀類藥物治療肺動脈高壓作用機制的研究進展［J］.國際呼吸雜志，2007，27(10):794－797.

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