胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803的細胞周期分布及侵襲能力之比較研究▲

馬鵬飛 陳俊強 劉金祿 王 震

(廣西醫科大學第一附屬醫院胃腸腺體外科，南寧市 530021)

胃癌(Gastric cancer，GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，超過70%的新發和死亡病例發生在發展中國家，其中又以東亞的發病率為最高［1～3］。臨床上對胃癌可采取手術、放療、化療等綜合治療措施，但仍有相當數量的患者最終死于癌灶的復發和轉移。目前認為胃癌的復發和轉移是多步驟、多因素、多基因參與的復雜過程，但具體機制仍不清楚。而腫瘤的惡性程度與其細胞的生物學特性密切相關，故對不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株進行研究，對研究胃癌的病因、發病機制及診斷治療大有裨益。本研究選取兩種常見的不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803，通過流式細胞術檢測這兩株細胞的周期分布情況，并應用Matrigel膠模仿人體細胞基底膜，通過計數穿過Transwell小室的相對細胞數目比較這兩種細胞株侵襲能力的差異，為體外深入研究胃癌細胞的增殖和侵襲能力奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 SGC-7901和MGC-803購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養基購自美國Gibco公司，標準胎牛血清購自美國HyClone公司，細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基公司，纖維粘連蛋白(fibronectin，FN)購自美國Solarbio公司，基底膠(Matrigel膠)購自美國BD公司，結晶紫購自美國Sigma公司，Transwell小室購自美國CORNING公司。

1.2 方法

1.2.1 培養條件和方法 將SGC-7901和MGC-803培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液，37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養箱內培養。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞周期分布 胰酶消化并收集細胞，PBS洗滌細胞一次(2 000 rpm離心，5 min)，收集并調整細胞濃度為1×106個/mL，制備的單細胞懸液用體積分數為70%的乙醇固定，4℃過夜，用PBS洗去固定液，加入100 μL RNAaseA，37℃水浴30 min，再加入400 μL熒光染料(PI)染色混勻，4℃避光30 min，流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm，用620 nm波長濾器檢測紅色熒光，收集數據待分析。用MultiCycle分析軟件進行細胞周期的分析，分別計算G0/G1期、S期和G2/M期的相對比例。

1.2.3 細胞侵襲實驗 用50 μL含5 μg纖維粘連蛋白的PBS處理Transwell小室聚碳酸酯膜的下表面。室溫下過夜干燥，Matrigel膠用冷的不含血清的 DMEM稀釋成1.25 mg/mL。分別取50 μL涂抹在小室基底膜的上表面，使上表面完全被覆蓋。然后37℃孵育4～5 h形成膠狀，將細胞用無血清的DMEM洗3遍。消化后重懸于含0.5%胎牛血清的 DMEM 中。調整細胞濃度(均為3.0×105個/mL)。用溫暖的無血清的DMEM水化膠狀的Matrigel膠，將100 μL單細胞懸液加入上室，將500 μL含5%胎牛血清的DMEM加入下室，37℃、5%CO2條件下培養48 h。取出Transwell小室，吸凈培養液，用棉簽擦去上室內的細胞;小室基底膜用甲醛固定20 min，PBS沖洗，用結晶紫染色30 min。光鏡下觀察。隨機選取5個視野計數細胞個數，取其平均值。通過計數侵襲細胞的數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力，實驗重復三次。

1.3 統計學方法 實驗數據采用SPSS 16.0統計軟件分析，以“均數±標準差”(±s)表示，采用兩樣本均數比較，t檢驗，檢驗水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測胃癌細胞的周期分布 SGC-7901在G0/G1期、G2/M 期、S期的分布百分比分別為(63.74±3.40)%、(30.23±2.70)%、(6.03±0.70)%，見圖1;MGC-803在G0/G1期、G2/M期、S期的分布百分比分別為 (62.94±6.13)%、(28.67±7.76)%、(8.39±1.69)%，見圖2;兩胃癌細胞株對應的周期時相分布百分比差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖3。

圖1 SGC-7901細胞周期分布圖

圖2 MGC-803細胞周期分布圖

圖3 SGC-7901和MGC-803細胞周期分布的比較(＊＊P＞0.05)

2.2 Transwell小室檢測兩胃癌細胞株的侵襲能力 SGC-7901和MGC-803穿過涂抹有Matrigel膠的聚碳酸酯膜的細胞數分別為65.67±6.03(見圖4)和94.5±3.68(見圖5)，后者是前者的1.44倍，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖6。

圖4 SGC-7901侵襲實驗中穿越基底膜的細胞

圖5 MGC-803侵襲實驗中穿越基底膜的細胞

圖6 SGC-7901和MGC-803侵襲細胞數目的比較(*P＜0.05)

3 討論

胃癌是一種病死率極高的惡性腫瘤。據統計，在各種癌癥致死因素中，胃癌排在第二位［4］。復發和轉移仍然是影響胃癌療效的主要因素，但具體機制尚不清楚［5］。而腫瘤的惡性程度與其細胞的生物學特性密切相關，惡性程度越高的胃癌細胞株體外侵襲能力越強;反之，惡性程度低的胃癌細胞株體外侵襲能力則越弱。因此在體外對不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株進行研究，可為胃癌的病因、發病機制及診斷治療的研究奠定基礎。

本研究選取的兩種胃癌細胞中，MGC-803來源于低分化胃黏液腺癌細胞［6］，SGC-7901來源于淋巴結轉移的胃腺癌［7］。我們應用流式細胞術比較兩種細胞株的周期分布情況，結果顯示這兩種胃癌細胞株對應的周期時相分布百分比差異無統計學意義(P＞0.05)。流式細胞術是利用細胞內DNA能夠和熒光染料(PI)結合的特性，通過流式細胞儀對細胞內DNA的相對含量進行測定，而細胞內的DNA含量隨細胞周期進程發生周期性變化，故對DNA周期檢測可用來反映細胞周期的各個期的分布狀況，即細胞增殖情況。也就是說，如果僅僅從周期分布和統計學上來看，這兩種細胞株的增殖能力是一樣的，但考慮到胃癌細胞的增殖是一個多種因素相互影響的復雜過程，其相關原因及具體機制尚需進一步研究。

Matrigel基質是一種從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠惡性腫瘤基膜分離的再生基膜，類似人體細胞基底膜，主要成分是層黏蛋白、Ⅳ型膠原和蛋白糖苷、肝素、硫酸鹽等成分。在體外侵襲實驗中，將Matrigel膠涂抹在Transwell小室基底膜的上表面，細胞只有將該層降解后才能進入下面的含高營養細胞培養液中。一般正常細胞無穿透能力，而腫瘤細胞則具有降解Matrigel膠的能力，侵襲性越強，穿越該層的能力就越強。本實驗中，我們將Transwell小室中分別種植不同的胃癌細胞，通過檢測穿越小室基底膜相對細胞數量來反映兩組胃癌細胞侵襲能力的差異，結果發現，MGC-803穿過涂抹有Matrigel膠的聚碳酸酯膜的細胞數(94.5±3.68)是SGC-7901(65.67±6.03)的1.44倍，差異具有統計學意義(P＜0.05)，表明MGC-803的侵襲能力強于SGC-7901。王玉巧等［8］在研究胃癌的遷移實驗中也發現了類似的現象，但我們的實驗是用Matrigel膠模擬人的基底膜，更能接近人體的生理功能。這為進一步研究不同胃癌細胞株的侵襲機制奠定了堅實的基礎。

［1］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69－90.

［2］ Nishiyama M.Chemotherapy for gastric cancer in Japan［J］.Int J Clin Oncol，2008，13(3):191－192.

［3］ Brenner H，Rothenbacher D，Arndt V.Epidemiology of stomach cancer［J］.Methods Mol Biol，2009，472:467－477.

［4］ Brenner B，Hoshen MB，Purim O，et al.MicroRNAs as a potential prognostic factor in gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2011，17(35):3976－3985.

［5］ Kim HJ，Eun JY，Jeon YW，et al.Efficacy and safety of oxaliplatin，5-fluorouracil，and folinic acid combination chemotherapy as first-line treatment in metastatic or recurrent gastric cancer［J］.Cancer Res Treat，2011，43(3):154－159.

［6］ 林超鴻，富志民，劉亞倫，等.人體胃癌細胞株SGC-7901的建立［J］.腫瘤，1981，2(1):1－3.

［7］ 王凱華.人體胃低分化粘液癌細胞系的建立及其生物學特性的初步觀察［J］.實驗生物學報，1983，16(5):257－262.

［8］ 王玉巧，韓 梅，侯曉麗.四種人胃癌細胞體外增殖和侵襲能力比較［J］.臨床和實驗醫學雜志，2006，5(10):1486－1489.