基因OCT4、CD133在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

倪靜怡,楊 磊,朱興華,茅國新

(南通大學附屬腫瘤醫院,1.腫瘤內科;2.病理科,江蘇南通,226361; 3.南通大學附屬醫院腫瘤科,江蘇南通,226001)

統計分析表明[1],ⅠA～ⅢA期能完全切除的非小細胞肺癌(NSCLC)患者5年生存率為23%～67%,晚期NSCLC的5年生存率不超過15%。雖然近年來靶向治療使NSCLC的有效率有所提高,但總的5年生存率改變很小。導致肺癌患者出現復發、耐藥及轉移等現象的根源是腫瘤組織中的小部分腫瘤干細胞(CSCs)。CSCs具備無限增殖、自我更新和多向分化潛能,是形成腫瘤和促使腫瘤不斷生長的根源,具有抗損傷、耐藥及轉移能力,針對CSCs的治療將是治療惡性腫瘤新的突破點。確定特異性的CSCs標記物,對CSCs的分選及靶向腫瘤干細胞藥物的開發都有重要意義,但是目前尚未發現分離鑒定CSCs的統一分子標記。既往研究[2-5]發現,在多種實體瘤CSCs中均有CD133表達,并經體內外試驗證實了CD133+細胞具有腫瘤干細胞特征。還有研究[6]發現,胚胎干細胞的特異性基因 OCT4在NSCLC中表達,并與CD133+肺癌細胞有一定聯系。本研究采用免疫組化的方法,檢測NSCLC組織、癌旁組織及正常肺組織中OCT4及CD133的表達水平,并探討OCT4、CD133表達與臨床病理特征之間的關系,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2007年5月—2009年5月間在本院經手術切除或活檢、病理證實的NSCLC患者50例,均有術后隨訪資料。其中男27例,女23例,年齡35～70歲,中位年齡53歲;肺鱗癌29例,腺癌18例,大細胞癌3例;高分化15例,中分化29例,低分化及未分化6例;有遠處轉移者15例。同時選取20例癌旁組織和20例正常肺組織作為對照。

1.2 試劑與儀器

羊抗人CD133多克隆抗體、鼠抗人OCT4單克隆抗體、ELIVISON試劑盒(PV900)、二氨基聯苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒,均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

所有標本都經過10%甲醛固定、常規石蠟包埋,并制成4μm的連續切片,行免疫組化染色,將切片脫蠟至水化,高溫高壓修復;將抗體稀釋至1∶100,取已知陽性組織作陽性對照,磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照。DAB顯色,用蘇木精復染、脫水、透明,最后封片。采用免疫組化法分析NSCLC組織與癌旁組織、正常肺組織中OCT4和CD133表達情況,分析OCT4和CD133表達與患者的臨床特征之間的關系以及NSCLC癌組織中OCT4、CD133的相關性。

1.4 判斷標準

免疫組化結果觀察由2名資深病理科醫師共同閱片。按著色細胞百分數計分,<20%為0分,≥20%且<50%為1分,≥50%為2分;按著色強度計分,無著色為0分,淡黃色顆粒為1分,棕黃色顆粒為2分。將色細胞百分數計分與著色強度計分相乘,總計分0分為陰性(-),1～2分為弱陽性(+),4分為強陽性(6)。

2 結 果

2.1 3組OCT4、CD133蛋白的表達

50例NSCLC癌組織、癌旁組織及正常肺組織OCT4蛋白表達率分別為42.00%(21/50)、10.00%(2/20)和15.00%(3/20),而CD133蛋白表達率分別為61.00%(32/50)、10.00%(2/20)和20.00%(4/20),癌旁組織及正常肺組織OCT4、CD133蛋白的表達率均顯著低于NSCLC癌組織(P<0.05)。OCT4陽性顆粒主要定位在細胞核,CD133陽性顆粒主要定位在細胞膜,均呈散在或小簇分布,見圖1。

圖1 NSCLC腫瘤組織免疫組化染色示例圖 (20倍) A.OCT4免疫組化染色 (1例腺癌患者); B.OCT4免疫組化染色 (1例鱗癌患者); C.CD133免疫組化染色 (1例腺癌患者); D.CD133免疫組化染色 (1例鱗癌患者)

2.2 OCT4、CD133蛋白與NSCLC患者臨床病理特征的關系

OCT4在低分化及未分化癌組織中的表達率高于高、中分化組織(P<0.05),OCT4及CD133在有遠處轉移的NSCLC癌組織中的表達率高于無遠處轉移(P<0.05),提示OCT4在NSCLC癌組織中的表達率與其分化程度以及有無遠處轉移有關,CD133在NSCLC癌組織中的表達率與有無遠處轉移有關。見表1。

表1 OCT4、CD133蛋白表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 OCT4與CD133的相關性

50例NSCLC癌組織中,OCT4與CD133共同陽性15例,共同陰性12例,見表2。經統計學分析,2者之間有明顯相關性(P=0.0218)。

表2 OCT4與CD133蛋白的共表達關系(例)

3 討 論

干細胞是一種未分化的原始細胞,在特定的條件下,它可以分化成不同的功能細胞,形成多種組織和器官[7]。1997年,Bonnet等從髓系白血病患者骨髓中分離鑒定出第1個CSCs:白血病干細胞,其表型為 CD34+CD38-。Collins等[3]從前列腺癌組織中分離出了前列腺癌干細胞,其表型為 CD44+/α2β1hi/CD133+,這些前列腺癌干細胞在前列腺癌組織所占的比例約為0.1%。接著O′Brien等[4]在結腸癌的組織中分離出了人結腸癌干細胞,它也表達CD133+,同時還發現這群細胞具有自我更新和分化重建的能力。

在白血病、前列腺癌和結腸癌等腫瘤中相繼發現了CSCs之后,人們將目光聚集到肺癌上,尤其是NSCLC。2005年,Kim等[8]采用流式細胞術分選從支氣管和肺泡導管交界處分離出一群細胞,其表面標志為Sca-1+CD45-Pecam-CD34+,即支氣管肺泡干細胞(BASCs)。在正常情況下BASCs處于休眠狀態,當支氣管和肺泡發生損傷時,BASCs開始增殖,此時BASCs顯現出自我更新特性,并且能夠分化成其它類型的上皮細胞。另外,BASCs具有自我更新、克隆性增殖及多向分化潛能,可見BASCs具備干細胞特性。Eramo等[9]在體外實驗中發現,在NSCLC組織中存在著一群表達CD133+的未分化細胞,它能在無血清培養基中不斷增殖;同時Eramo還在重度免疫缺陷小鼠體內接種了1×104個CD133+的肺癌細胞,結果發現小鼠體內出現了與原發瘤相同表型的腫瘤,可見,此類細胞有著干細胞特性。Pircher等[10]經過實驗發現,NSCLC中的內皮祖細胞也表達CD133,因此他們認為NSCLC中的內皮祖細胞可能來源于肺癌干細胞。

人的OCT4基因位于6號染色體上(6p21.31),長度為16.40 kb,具有多個轉錄起始位點,轉錄不同的mRNA亞型,從而翻譯成多種蛋白質。Sotomayor等[11]發現在前列腺癌中有一種被認為是干細胞來源的細胞,即神經內分泌細胞,OCT4可標記此種細胞。CD133基因位于4號染色體, CD133蛋白為細胞膜蛋白超家族成員。Huang等[12]經過臨床研究發現CD133+腫瘤細胞雖數量極少,但對腫瘤的增殖、分化、浸潤以及復發有著重要的意義。

本研究中,在正常肺組織及癌旁組織中OCT4和CD133均呈低表達,而在NSCLC組織中陽性率分別為42.00%和61.00%;OCT4高表達與肺癌的分化程度、有無遠處轉移相關,與性別、年齡、病理類型等無關;OCT4表達隨分化程度的降低而增高,有遠處轉移的組織顯著高于無遠處轉移;CD133高表達與人類肺癌的有無遠處轉移相關;OCT4與CD133之間存在明顯相關性。總之,OCT4和CD133在肺癌中高表達,與肺癌的分化、進展、轉移有密切的關系,可作為一種有價值的分子標志物,為肺癌的早期預防和早期診斷服務。此外,OCT4分子與CD133分子在NSCLC的發生、發展、分化及遠處轉移上或許存在某些相關性或協同作用,有待進一步研究。

[1] Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2008 [J].CA Cancer J Clin,2008,58(2):71.

[2] Yin S,Li J,Hu C,et al.CD133positive hepatocellular carci2 noma cells possess high capacity for tumorigenicity[J].Int J Cancer,2007,120(7):1444.

[3] Collins A T,Berry P A,Hyde C,et al.Prospective identifi2 cation of tumorigenic prostate cancer stem cells[J].Cancer Res,2005,65(23):10946.

[4] O′Brien C A,Pollett A,Gallinger S,et al.A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodefi2 cient mice[J].Nature,2007,445(7123):106.

[5] Eramo A,Lotti F,Sette G,et al.Identification and expan2 sion of the tumorigenic lung cancer stem cell population[J]. Cell Death Differ,2008,15(3):504.

[6] Chen Y C,Hsu H S,Chen Y W,et al.Oct4expression maintained cancer stem-like properties in lung cancer-de2 rived CD133-positive cells[J].PLoS One,2008,3(7): 2637.

[7] Schrattenholz A,Kiemm M.Neuronal cell culture from hu2 man embryonicstem cells as in model for neuroprotection[J]. AlTEX,2007,24(1):9.

[8] Kim C F,Jackson E L,Woolfenden A E,et al.Identifica2 tion of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer[J].Cell,2005,121(6):823.

[9] Eramo A,Lotti F,Sette G,et al.Identification and expan2 sion of the tumorigenic lung cancer stem cell population[J]. Cell Death Differ,2008,15(3):504.

[10] Pircher A,Khler C M,Skvortsov S,et al.ncreased numbers of endothelial progenitor cells in peripheral blood and tumor specimens in non2small cell lung cancer:a methodological challenge and an ongoing debate on the clinical relevance[J]. Oncol Rep,2008,19(2):345.

[11] Sotomayor P,Godoy A,Smith G J,et al.Oct4A is ex2 pressed by a subpopulation of prostate neuroendocrine cells [J].Prostate,2009,69(4):401.

[12] Huang Q,Zhang Q B,Dong J,et al.Glioma stem cells are more aggressive in recurrent tumors with malignant progres2 sion than in the primary tumor,and both can be maintained long-term in vitro[J].BMC Cancer,2008,8(2):304.