縫隙連接蛋白Cx43在SD大鼠電點燃癲癇模型中的表達

宋建華,謝錫駒

(1.江蘇省南通市第三人民醫院神經內科,江蘇南通,226006; 2.南京醫科大學第一附屬醫院普外科,江蘇南京,210036)

癲癇的發病可能與興奮性氨基酸增多、神經元缺失、膠質細胞增多、基因變異以及遺傳等有密切的關系[1],而這些病變都是通過異常、過度的同步性放電來導致癲癇發作的[2]。研究發現[3],縫隙連接蛋白表達異常與癲癇間存在時間同一性。癥狀性癲癇病灶總是存在于具有縫隙連接的大腦灰質區;不同年齡段癲癇發作的形式與縫隙連接及縫隙連接蛋白在不同年齡段的表達程度相關[4];外傷性癲癇之所以在外傷后數月或數年后發病,與損傷的腦組織修復過程中形成了異常的縫隙連接有關[5]。這些研究均提示,縫隙連接的異常表達可能是癲癇發病的基礎。本實驗在制模過程中,應用特異性縫隙連接蛋白抑制劑苷酸,以及臨床經驗性使用預防癲癇的藥物苯妥英鈉進行干預,觀察大鼠電點燃癲癇模型成模過程是否受到抑制,同步檢測縫隙連接蛋白Cx43的表達水平,探討縫隙連接蛋白與癲癇形成的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物:健康成年雄性SD大鼠32只,清潔級,體重220～250 g,由南通大學實驗動物中心提供。自然晝夜節律光照,恒溫25℃,在鼠籠內可自由獲得物與水,適應性飼養3 d。主要試劑購于江蘇碧云天生物技術有限公司,北京博奧森生物技術有限公司。自制雙極漆包鎳鉻電極(直徑0.1 mm)。實驗平臺由南通大學航海醫學研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 癲癇大鼠模型:①電極植入:(前囟后3. 5 mm,旁開2.0 mm,深度2.5 mm)。②測定SD大鼠痙攣閾值。痙攣閾值確定后5 min以上就可以開始點燃實驗。③雄性SD大鼠隨機分為假模型組、模型組、苷酸組、苯妥英鈉組。④從第4天開始假模型組、模型組予生理鹽水腹腔注射(10 mL/kg),苷酸組予苷酸腹腔注射(20 mg/ kg),苯妥英鈉組予苯妥英鈉灌胃(100 mg/kg),均1次/d。因為32只SD大鼠的痙攣閾值范圍為220～240μV。統一選定200μV作為閾值下刺激。從第4天開始,假模型組僅連接多道生理記錄儀,記錄腦電圖,不發放刺激電流。其余3組均持續點燃2 d休息2 d,每天上、下午各點燃一次,共3周。3周后停止藥物干預與電點燃。

1.2.2 癇性發作的觀察與腦電圖記錄:根據經典的大鼠癲癇發作Racine分級判斷大鼠是否有癲癇發作行為。腦電圖記錄:在每次點燃前5 min開始記錄大鼠腦電圖變化,每次記錄30 min。記錄參數設置為:采樣率1 000 Hz,掃描速度100 ms/div,靈敏度200μV,時間常數0.2 s,低通濾波70 Hz。當出現尖波、棘波、尖(棘)慢綜合波、多棘慢綜合波時判定為癲癇腦電活動。

1.2.3 免疫蛋白印跡(Western blot):所有SD大鼠均于術后32 d急性斷頭取腦,提取海馬(電極部位)蛋白,-80℃保存備用。標本收集完成后測定Cx43表達。

2 結 果

2.1 大鼠癇性發作的表現與評分

假模型組大鼠在4周內均未出現癇性發作。模型組大鼠在亞閾值刺激5 d后就出現Ⅰ～Ⅱ級發作,2周后可見Ⅳ～Ⅴ級發作,但是未見癲癇持續(SE)。干預組大鼠在10 d后出現Ⅰ～Ⅱ級發作,3周后可見Ⅲ級發作,未出現Ⅳ～Ⅴ級發作。對每只SD大鼠按癇性發作的最高級別評分0～5分。每7 d評分一次,見表1。

表1 各組大鼠不同時間點發作Racine評分比較(n=8,±s)

表1 各組大鼠不同時間點發作Racine評分比較(n=8,±s)

與模型組比較,33P<0.01

組別 7 d 14 d 21 d 28 d假模型組 0 0 0 0模型組 2.00±0.18 3.62±0.18 4.62±0.18 4.50±0.16苷 酸組2.15±0.1233 2.41±0.2233 2.28±0.1833苯妥英鈉組 0 2.07±0.1433 2.59±0.2633 2.33±0.1933 0

2.2 腦電圖變化

2.3 Western blot測定CX43的表達

4組兩兩相比,差異均有統計學意義(P< 0.01),苷酸組與苯妥英鈉組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3-4。

3 討 論

在癲癇的發病機制中,神經元異常同步放電成為大家所公認的原因。縫隙連接是目前發現的細胞間唯一能夠直接進行物質信息交換的快通道,它可能是神經膠質細胞υ神經元信息交流的部位之一。早期研究已發現,2個相鄰神經節細胞動作電位傳遞的間隔時間幾乎為零,縫隙連接的這種直接傳遞,被認為是促進神經元活動達到同步化的重要原因,所以推測癲癇灶內縫隙連接在癲癇發病過程中發揮重要作用。

實驗結果顯示,電點燃后SD大鼠海馬中縫隙連接蛋白Cx43表達明顯增高,加用苷酸[6]、苯妥英鈉[7]干預后,其表達增高程度受到抑制。受到干預的SD大鼠癇性發作改善,Racine分級評分降低。同步腦電圖描記到的癇性電流的振幅下降。檢測到的Cx43表達下降,具有同步性。苷酸是縫隙連接蛋白特異性抑制劑,作用于縫隙連接?？p隙連接蛋白受到苷酸抑制后,SD大鼠的癇性發作Racine評分降低,腦電圖癇性腦電波振幅受到抑制。說明縫隙連接蛋白是癇性發作的物質基礎。

圖1 28 d時的腦電圖A.假模型組;B.模型組;C.苷酸組;D.苯妥英鈉組

圖2 腦電波峰峰值比較A.假模型組;B.模型組;C.苷酸組;D.苯妥英鈉組

圖3 Weston blot測定的Cx43表達

圖4 4組Cx43表達情況比較

膠質細胞的生理作用是維持神經元所在的內環境穩定,維護神經元的正常電活動。既往的研究發現[8],膠質細胞在癲癇的形成于發作中也扮演了重要角色。在星形膠質細胞上表達的Cx有3種[9]:Cx26、Cx30和Cx43。其中Cx43的表達量占比接近90%,推測Cx43在癲癇中的形成中占主導作用[10]。因此選擇海馬星型膠質細胞表達的Cx43作為檢測指標。實驗選擇的電點燃模型與以往的其他模型比較,最大的特點是不引起神經膠質增生、壞死,神經變性等形態學變化[11-15]。實驗模型SD大鼠海馬區Cx43表達增加是單個膠質細胞上Cx43增加的結果。過度表達的縫隙連接蛋白在膠質細胞上組成縫隙連接。降低了相鄰神經元間的電阻,降低了神經元同步放電的閾值。Cx43為什么會過度表達呢?

每一個膠質細胞都是相對獨立的個體,具有一定的電容,存在一定電阻。當電流負荷超過膠質細胞最大電容時就會發生細胞膜擊穿,細胞膜擊穿后超負荷電流得到快速釋放。在這個過程中未誘導單個細胞凋亡,沒有出現膠質細胞增生改變。超負荷電流釋放后,細胞膜自我修復。在點燃試驗中,超負荷電流-細胞膜擊穿-細胞膜修復的過程出現循環反復。只有增加細胞間縫隙連接,超負荷電流才能迅速釋放,不會出現細胞膜擊穿。最終誘導膠質細胞間縫隙連接增加,電阻降低,形成固定的潛在電流通路,降低了臨近神經元同步放電的閾值。當癇性電流[2]出現時,就沿著固定的通路擴布。這也正是為什么癲癇的發作形式眾多,但是每一個具體患者的發作形式總是相對刻板的原因?？p隙連接異常增多,形成固定的低電阻電流通道是癲癇形成的重要條件。

在癲癇形成的過程中出現的Cx43過度表達是癲癇形成的物質基礎。過度表達的縫隙連接蛋白在細胞膜上組成縫隙連接,形成固定的潛在電流通路。抑制縫隙連接蛋白過度表達,阻斷異?？p隙連接,癲癇形成也受到抑制?？p隙連接蛋白和異?？p隙連接是今后癲癇預防與治療的一個有效靶點。

[1] 賈建平.神經病學[M].北京,人民衛生出版社,2008:25.

[2] 雷革勝,王文挺,李柱一,等.應用腦片紅外可視膜片鉗技術觀察大鼠海馬神經元癲癇樣放電[J].中國神經免疫和神經病學雜志,2008,4(15):266.

[3] Lowenstein DH.Epilepsy after head injury:an overview[J]. Epilepsia,2009,50(Suppl 2):4.

[4] Ben-Ari Y,Holmes GL.Effects of seizures on developmen2 tal processes in the immature brain[J].Lancet Neural,2006, 5(12):1055.

[5] Karpuk N,Burkovetskaya M,Fritz T,et al.Neuroinflam2 mation leads to region-dependent alterations in astrocyte gap junction communication and hemichannel activity[J].J Neu2 rosci.2011,31(2):414.

[6] Bostanci MO,Bagirici F.Anticonvulsive effects of carbenox2 olone on penicillin-induced epileptiform activity:an in vivo study[J].Neuro-pharmacology,2007,52(2):362.

[7] 呂華榮,王 峻,吳 星,等.苯妥英鈉逆轉膠質母細胞瘤多藥耐藥實驗研究[J].實用臨床醫藥雜志,2011,15 (7):76.

[8] 靳 哲,趙忠新.星形膠質細胞在癲癇發病中的作用研究[J].世界臨床藥物,2012,33(1):5.

[9] Rash J E,Olson CO,Davidson KG,et al.Identification of connexin36 in gap junctions between neurons in rodent locus coeruleus[J].Neuroscience,2007,147(4):938.

[10] 蔡正旭,張淑琴,郭慧淑,等.KA注射致癇大鼠腦組織中CX43的表達及其意義[J].中風與神經疾病雜志,2005, 22(2):115.

[11] Jackson J,Chugh D,Nilsson P,et al.Altered synaptic prop2 erties during integration of adult-born hippocampal neurons following a seizure insult[J].PLoS One,2012,7(4): e35557.

[12] 侯小兵,周 銓,王國福,等.癲癇術中致癇灶切除前后腦電監測棘波減少的量化指標[J].南方醫科大學學報, 2010,30(10):2363.

[13] 劉淑丹,王晗知,何揚濤,等.氯化鋰-匹羅卡品致癇幼鼠成年后少突膠質細胞轉錄因子Olig2在腦白質區的表達[J].華南國防醫學,2010,3(24):174.

[14] 周蘭華.護理干預對提高成人癲癇患者生活質量的效果觀察[J].實用臨床醫藥雜志,2010,14(22):58.

[15] 張伏龍.氧化苦參堿對癲癇性腦損傷神經元的保護作用[J].實用臨床醫藥雜志,2010,14(19):66.