調節性樹突狀細胞對哮喘小鼠氣道炎癥及白介素12和IgE表達的影響

劉煥星，曹 平

哮喘是一種慢性呼吸系統疾病，它以加劇的氣道炎癥、氣道高反應性及氧化應激為特點［1］。哮喘的發生與炎性細胞，包括嗜酸粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞和輔助性T細胞的浸潤有關［2］。已有研究表明，2型輔助性T淋巴細胞通過產生細胞因子介導炎癥的級聯反應，包括嗜酸粒細胞的募集、IgE和活化氧的產生以及肥大細胞的激活，共同構成氣道高反應性的必要遞質［3－5］。建立機體對過敏原的特異性耐受，可抑制哮喘的發生與發展。

樹突狀細胞 (dendritic cells，DC)是專職的骨髓來源抗原提呈細胞，是一群異源性、異質性的細胞群體。盡管DC是在Steinman［6］研究免疫原性時發現的，這些細胞在維持免疫耐受方面同樣發揮了重要作用［7］。新近提出的調節性樹突狀細胞 (regulatory dendritic cells，rDC)具有負向調節免疫反應的功能，在體內外誘導T細胞低反應性及耐受性。

我們前期的研究已經證實，肺臟基質細胞培養上清液可以誘導成熟樹突狀細胞 (mature dendritic cells，mDC)分化發育成一種rDC，其細胞形態學、免疫分子表型表達、細胞因子分泌都不同于mDC，缺乏活化T細胞的重要信號［8］。本實驗利用這種rDC的致耐受能力，通過誘導小鼠過敏性哮喘模型，研究其對卵清蛋白 (OVA)激發的氣道過敏性炎癥的影響及白介素12(IL－12)、IgE表達的變化，探討其在哮喘中的作用。

1 材料與方法

1.1 rDC的制備 簡要的說用含重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (rmGM－CSF)(10 ng/ml)、重組小鼠細胞因子白介素4(rmIL－4)(1 ng/ml)的RPMI1640完全培養基與小鼠骨髓細胞共培養8 d，用CD11c磁珠陽性選擇CD11c+細胞，脂多糖 (LPS) (1 ng/ml)刺激24 h使其成為mDC，然后用含有50%肺臟基質細胞培養的上清液作為完全培養基共培養1周，得到免疫表型為CD11clowIalowCD11bhigh的rDC［8］。

1.2 主要試劑及儀器 OVA、LPS等購自Sigma公司;IL－12、IgE ELISA試劑盒購自R＆D公司;rmIL－4、rmGM－CSF購自美國Peprotech公司;普通倒置光學顯微鏡 (Olympus IX70)，普通光學顯微鏡 (OlympusCH20)，BIO－RAD 680酶標儀，魚躍牌超聲霧化器。

1.3 哮喘小鼠模型的建立 除正常組小鼠外，其余各組均經如下處理誘導哮喘樣癥狀:以首次注射OVA抗原當日為第0天 (Day0)計，于Day0和Day9分別予0.1%OVA的氫氧化鋁〔Al(OH)3〕溶液 (0.1 ml/只)腹腔注射，進行初次致敏和加強致敏。Day14～20:連續7 d予2%OVA的0.9%氯化鈉溶液進行霧化攻擊，1次/d，30 min/次。抗原激發后觀察小鼠反應，表現為呼吸加深加快，頭面部瘙癢，安靜少動，弓背，二便失禁為陽性反應，表明哮喘模型建立成功。

1.4 實驗動物與分組 40只6～8周齡的C57BL/6近交系小鼠，雌性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物分組及rDC的免疫如下:按隨機數字表法分成A、B、C、D組，每組10只。A組:正常組，分別在Day0、Day7、Day14，按0.1 ml/只的量腹腔注射磷酸鹽緩沖液 (PBS)。B組:OVA組，未做處理的哮喘組。C組:mDC組，分別在Day0、Day7、Day14，按5×106/鼠的細胞量腹腔注射mDC。D組:rDC組，分別在Day0、Day7、Day14，按5×106/鼠的細胞量腹腔注射rDC。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 取材 末次霧化激發24 h后 (第21天)，采用摘除眼球取血的方法收集標本。取血靜置1 h，經離心機分離血清。－20℃保存，待測細胞因子。脫頸處死小鼠，暴露胸腔和氣管，分離氣管，結扎右主支氣管，向左肺內灌注1 ml的PBS，停留片刻后回吸，獲得肺泡灌洗液。常規留取右肺中葉，行病理學觀察。

1.5.2 肺部標本的制備 取右肺中葉，用4%多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋，切成4 μm厚切片，行蘇木素－伊紅 (HE)染色制片。觀察肺部的炎癥病理改變。

1.5.3 ELISA法檢測小鼠血清中IL－12、IgE及肺泡灌洗液中IL－12的表達水平 按照R＆D公司ELISA試劑盒操作，在BIO－RAD 680酶標儀上讀取結果。

1.6 統計學方法 用SPSS 13.0統計軟件進行處理分析，計量資料以 ()表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學觀察 (HE染色) 正常組小鼠支氣管黏膜上皮、肌層及肺泡壁完整。支氣管管腔和肺泡腔規則，結構正常，無炎性細胞浸潤。支氣管管腔、肺泡腔內無分泌物潴留(見圖1)。OVA組哮喘小鼠 (見圖2)與mDC組哮喘小鼠(見圖3)的病理學表現相似。支氣管管壁增厚，管腔狹窄，支氣管上皮細胞增生明顯，可見較多炎性細胞浸潤 (以嗜酸粒細胞和中性粒細胞為主)，支氣管周圍小血管擴張、充血，肺泡壁增厚且明顯塌陷，肺泡腔明顯減少，其內可見較多炎性細胞浸潤，支氣管管腔、肺泡腔內可見分泌物潴留。rDC組哮喘小鼠支氣管壁明顯變薄，小血管輕度擴張、充血，炎性細胞浸潤較前兩組明顯減少，肺泡壁塌陷較前兩組減輕 (見圖4)。

2.2 血清中IL－12、IgE水平的比較 4組小鼠血清中IL－12、IgE比較，差異均有統計學意義 (P＜0.01)。其中rDC組血清中IL－12的水平高于OVA組，IgE低于OVA組，差異均有統計學意義 (P＜0.01)。mDC組血清中IL－12、IgE水平與OVA組比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

圖1 正常組小鼠肺組織 (HE，×100)Figure 1 Lung tissues of normal group mice(HE， ×100)

表1 4組小鼠血清中IL－12及IgE水平的比較 (，pg/ml)Table 1 Comparison of IL－12 and IgE levels between four groups

表1 4組小鼠血清中IL－12及IgE水平的比較 (，pg/ml)Table 1 Comparison of IL－12 and IgE levels between four groups

注:與OVA組比較，*P＜0.01，△P＞0.05

組別 只數IL－12 IgE正常組 10 28±4 25±5 OVA組 10 20±4 62±8 mDC組 10 18±5△ 58±8△rDC組 10 57±6* 32±5*F 值0.00 0.00 149.4 77.3 P值

2.3 肺泡灌洗液中IL－12水平的比較 4組小鼠肺泡灌洗液中IL－12水平比較，差異有統計學意義 (F=81.2，P＜0.01)。其中rDC組肺泡灌洗液中IL－12水平高于OVA組，差異有統計學意義 (P＜0.01);mDC組肺泡灌洗液中IL－12水平與OVA組比較，差異無統計學意義 (P＞0.05，見表2)。

表2 4組肺泡灌洗液中IL－12水平的比較 (，pg/ml)Table 2 Comparison of IL－12 level in lavage fluid between four groups

表2 4組肺泡灌洗液中IL－12水平的比較 (，pg/ml)Table 2 Comparison of IL－12 level in lavage fluid between four groups

注:與OVA組比較，*P＞0.05，△P＜0.01

組別 只數IL－12正常組 10 29±6 OVA組 10 17±4 mDC組 10 17±5*rDC組 10 49±7△

圖2 OVA組小鼠肺組織 (HE，×100，右下角×400)Figure 2 Lung tissues of OVA group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

圖3 mDC組小鼠肺組織 (HE，×100，右下角×400)Figure 3 Lung tissues of mDC group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

圖4 rDC組小鼠肺組織 (HE，×100，右下角×400)Figure 4 Lung tissues of rDC group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

3 討論

本研究利用mDC與肺基質細胞上清液共培養獲得的rDC具有誘導免疫耐受的特性，接種至用OVA激發的哮喘小鼠。本研究結果顯示，這種rDC可減輕小鼠肺部炎癥表現，上調Th1型細胞因子IL－12水平并下調IgE水平。

哮喘是一種由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性非特異性炎癥。許多研究已證實T1亞群輔助細胞/T2亞群輔助細胞(Th1/Th2)平衡失調、Th2細胞活化亢進是哮喘發病機制中的關鍵環節［9］。IL－12在Th1型細胞因子免疫調節中起決定因素，并有研究表明IL－12不足時Th1反應低下而Th2反應增強。Zedan等［10］研究發現，哮喘兒童與正常兒童相比，血清IL－12水平明顯下降，并提出IL－12的產生不足可能是哮喘發病機制中的重要組分。IL－12可有效地促進Th1型細胞因子如干擾素γ(IFN－γ)的產生，抑制IgE的合成，抑制過敏原誘導的氣道高反應性及嗜酸粒細胞的浸潤［11］。而IFN－γ又可反過來加強IL－12的作用，這樣便形成了一個正反饋循環，加強了Th1的應答反應。另一方面又可抑制Th2型細胞因子如IL－13、IL－4的產生，抑制Th2的應答反應，降低B淋巴細胞合成過多的IgE，減輕氣道炎癥反應，降低氣道阻力，改善肺功能。IgE是一種反應抗體，通常情況下，主要由鼻咽部、扁桃體、支氣管等黏膜固有層的漿細胞產生，IgE水平的降低意味著IgE介導超敏反應的降低，血清中IgE水平取決于疾病炎癥反應的程度。

通過rDC干預后，IL－12的表達水平較哮喘小鼠高，且肺泡灌洗液和血清中IL－12的變化一致，而且IL－12能抑制過敏原誘導的氣道高反應性及嗜酸粒細胞在氣道聚集，使rDC組病理切片及灌洗液中的嗜酸粒細胞浸潤減少，炎癥減輕。提示rDC抑制哮喘氣道炎癥的作用可能與上調IL－12的表達，并抑制IgE產生有關。從而既糾正了Th1及Th2型細胞因子失衡又減輕了哮喘的氣道高反應性。

綜上所述，經誘導產生的rDC對哮喘小鼠氣道炎癥有治療作用。rDC應用于哮喘治療具有良好的前景。

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