氟西汀和碳酸鋰對慢性應激抑郁模型大鼠海馬腦源性神經營養因子表達的影響

吳 楓，孔令韜，湯艷清

抑郁癥是一種以情緒低落、思維遲緩、行為遲滯為主要表現的常見精神疾病，并伴有食欲減退和睡眠障礙等軀體癥狀，給患者本人、家庭、社會帶來了極大的危害和沉重的負擔［1］。但到目前為止，人們對抑郁癥的了解仍然很不完善，其病因、發病機制、治療等方面都存在巨大空白。應激被認為是導致抑郁癥發病的重要因素，近年來神經生物學研究也表明，應激事件等因素導致的大腦神經元可塑性改變及神經元功能受損可能是抑郁癥的重要發病機制之一。腦源性神經營養因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經營養因子 (neurotrophins，NTs)家族的成員之一，NTs家族是調節神經應答的一個分泌蛋白質家族，BDNF是NTs家族中表達最充分的一個，它不僅對神經元的分化極為重要，而且對成年大腦神經元的可塑性和存活具有重要意義。此外，當面臨缺氧、缺血、接觸神經毒物、應激等可能導致神經元損傷的情況時，BDNF還能提供神經保護作用［2］。臨床研究表明，抑郁癥患者的血清BDNF水平下降，而抗抑郁治療能夠提高血清BDNF水平［3-5］，但在抑郁癥發病過程中，BDNF在中樞神經系統的地位和作用尚不清楚。海馬是介導應激反應的重要腦區之一，與抑郁癥的發病關系密切［6］，也是大腦內BDNF表達的重要場所。國內外研究均表明慢性應激所致抑郁能導致海馬BDNF表達降低［7-8］，提示海馬BDNF表達減少可能在抑郁癥的發病過程中起關鍵作用。本研究通過觀察兩種不同作用機制抗抑郁藥物氟西汀和碳酸鋰對慢性應激抑郁模型大鼠海馬BDNF表達的影響，進一步探討BDNF在抑郁癥發病中的作用及抗抑郁藥物的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠60只，體質量180～220 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供，自由飲食水，光暗周期為12 h/12 h，實驗前適應性飼養1周。用隨機排列表法將大鼠分為4組:抑郁模型組、氟西汀組、碳酸鋰組和對照組，各15只。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠BDNF抗體 (武漢博士德生物工程有限公司)，生物素標記的山羊抗兔 IgG，ECL試劑盒(Santa Cruz Co.)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 第1～21天，對照組大鼠正常飼養;抑郁模型組、氟西汀組和碳酸鋰組大鼠隨機接受7種不同的刺激:電擊足底 (30～40 V，20 s/次，間隔1 min，共20次)、強迫游泳 (水溫20℃，5 min)、夾尾 (1 min)、搖晃 (水平往復，1次/s，共15 min)、熱應激 (45℃溫箱，5 min)、禁食 (48 h)、禁水 (24 h)。每天隨機給予一種刺激，每種刺激累計使用2 ～3次［7］。

1.2.2 行為學指標觀察 制備模型前后，對各組動物進行開場法測定大鼠5 min內的行為表現，包括水平穿越格數、豎立次數、修飾次數等。制備模型前后，對各組大鼠進行液體消耗實驗，計算24 h內蔗糖水消耗百分比 (糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.2.3 藥物干預 氟西汀片劑 (20 mg/片)、碳酸鋰片劑(250 mg/片)分別研磨成粉，溶于蒸餾水。第1～21天，每天應激前，氟西汀組大鼠灌胃氟西汀10 mg/kg，碳酸鋰組大鼠灌胃碳酸鋰60 mg/kg，抑郁模型組和對照組大鼠灌胃等體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.4 腦組織處理及Western blot測定 第22天，將大鼠斷頭處死，迅速取腦剝離海馬組織，置于4℃環境中，加入300 μl裂解液勻漿并離心1 h，吸取上清液，進行免疫印跡測定。具體步驟如下:考馬斯亮藍G250法測定蛋白濃度后加入樣品緩沖液調節樣品蛋白濃度;灌膠，加樣，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉液中4℃過夜;加入按1∶250比例稀釋的BDNF抗體，搖床上室溫孵育2 h;加入按1∶400稀釋的辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG，搖床上室溫孵育2 h;ECL法顯色;曝光，顯影，定影。Western blot結果用 Chemi Imager 5500 V2.03軟件掃描，再用Fluor Chen2.0軟件定量分析測得IDV值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料以 ()表示，多組間均數比較采用方差分析，對P＜0.05的指標再用q檢驗進行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠慢性應激前后行為學指標的變化 慢性應激前，4組大鼠的水平穿越格數、豎立次數、修飾次數和糖水消耗百分比間差異無統計學意義 (P＞0.05)。慢性應激21 d后:抑郁模型組大鼠水平穿越格數、豎立次數、修飾次數、糖水消耗百分比均顯著低于對照組 (P＜0.01);碳酸鋰組大鼠水平穿越格數、豎立次數、修飾次數和糖水消耗百分比均顯著低于對照組 (P＜0.05);氟西汀組大鼠水平穿越格數、豎立次數、修飾次數和糖水消耗百分比均顯著高于抑郁模型組 (P＜0.05)，水平穿越格數和豎立次數顯著低于對照組 (P＜0.05)，而修飾次數和糖水消耗百分比與對照組比較差異無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 慢性應激前后4組大鼠開場行為及糖水消耗的比較 ()Table 1 Comparison of rat behaviors and sucrose consumption among four groups before and after stress stimulation

表1 慢性應激前后4組大鼠開場行為及糖水消耗的比較 ()Table 1 Comparison of rat behaviors and sucrose consumption among four groups before and after stress stimulation

注: 與對照組比較，*P ＜0.01，▲P ＜0.05; 與抑郁模型組比較，△P ＜0.05

組別 只數應激前水平穿越格數 豎立次數 修飾次數 糖水消耗百分比 (%)應激后水平穿越格數 豎立次數 修飾次數 糖水消耗百分比 (%)對照組 15 37.9 ±10.9 22.6 ±8.2 7.2 ±3.3 70.1 ±8.7 46.0 ±18.9 20.3 ±11.3 8.4 ±2.7 68.5 ± 8.2抑郁模型組 15 35.3 ±13.8 23.8 ±5.8 8.8 ±3.9 70.4 ±6.9 23.2 ±23.0* 8.1 ± 7.2* 3.6 ±3.5* 55.4 ±11.7*碳酸鋰組 15 38.5 ±13.1 22.0 ±8.1 8.3 ±6.0 73.0 ±6.0 26.7 ±18.3▲ 9.2 ± 5.5* 4.3 ±2.6* 60.2 ± 7.9▲氟西汀組 15 35.6 ±13.6 24.0 ±7.4 10.0 ±4.8 72.6 ±9.1 39.1 ±17.8▲△ 13.4 ± 5.0▲△ 6.9 ±2.4△ 66.0 ± 7.3△F 0.236 0.259 0.986 0.557 4.380 7.770 9.182 6.569 P 值 0.871 0.854 0.406 0.646 0.008 0.000 0.000 0.001值

2.2 免疫印跡法測定海馬BDNF表達 慢性應激后4組大鼠海馬BDNF表達水平比較，差異有統計學意義 (P＜0.01);其中抑郁模型組大鼠海馬BDNF表達水平顯著低于對照組 (P＜0.01);碳酸鋰組大鼠海馬BDNF表達水平顯著高于抑郁模型組 (P＜0.01)，但仍顯著低于對照組 (P＜0.01);氟西汀組大鼠海馬BDNF表達水平顯著高于抑郁模型組 (P＜0.01)，與對照組比較差異無統計學意義 (P＞0.05，見表2)。

表2 免疫印跡法檢測4組大鼠海馬BDNF表達的比較 ()Table 2 Comparison of BDNF expression levels in hippocampus of rats in four groups by Western blotting method

表2 免疫印跡法檢測4組大鼠海馬BDNF表達的比較 ()Table 2 Comparison of BDNF expression levels in hippocampus of rats in four groups by Western blotting method

注:與對照組比較，*P＜0.01;與抑郁模型組比較，△P＜0.01

組別 只數 BDNF的表達水平 (IDV值)對照組 15 35 437±2 096抑郁模型組 15 22 796±7 392*碳酸鋰組 15 29 761±3 125＊△氟西汀組 15 32 659±3 359△F 值0.000 22.090 P值

3 討論

慢性不可預見性應激 (CUMS)抑郁模型［9］采用輕度、不可預見的應激因子模擬人類生活事件和環境應激刺激等心理社會因素，其理論依據與人類抑郁癥中慢性、低水平的應激原促進疾病發生、加速疾病發展的機制更接近，是近年來國內外廣泛應用的探討抑郁癥發病機制及抗抑郁藥物的藥理學研究的動物模型之一。本研究中，抑郁模型組大鼠經過21 d的慢性綜合應激，與對照組大鼠相比活動能力降低、探究行為減少、修飾次數減少以及糖水消耗百分比下降，這些表現與臨床抑郁癥患者所表現的精神運動改變、興趣或快感的喪失有很大程度的相似性，說明本研究中大鼠抑郁癥模型的制作是成功的［7］。

本研究結果表明，經過21 d的慢性綜合應激，抑郁模型組大鼠海馬BDNF表達較對照組顯著降低，這提示抑郁癥的發病可能與BDNF表達降低有關。海馬是介導應激反應的重要腦區，也是大腦具有可塑性和極易受損的一個腦區，因而在對抑郁癥發病機制的研究中備受關注。研究表明，慢性應激可導致海馬出現體積減小、細胞數目減少、細胞萎縮及增生抑制等多種神經元可塑性受損的表現，同時伴有學習、記憶和情緒反應的缺陷［10］。大腦內的BDNF主要由海馬和大腦皮質合成，在對正常神經元的營養及損傷神經元的再生和功能重建方面發揮重要作用。本研究結果中慢性應激導致大鼠海馬BDNF表達明顯減低，這與國外類似研究結果是一致的［11-12］，說明慢性應激導致的海馬神經元可塑性和功能受損可能與海馬BDNF表達降低有關，應激導致的大腦內BDNF水平下降可能是抑郁癥發病的內在病理生理機制之一。但也有研究得出了相反的結論［13］，這可能與不同研究采用的動物模型和應激強度的差異有關。

本研究還發現氟西汀組和碳酸鋰組大鼠在經過21 d的慢性綜合應激后，其行為學表現好于抑郁模型組大鼠，說明這兩種藥物都能改善抑郁行為，而且氟西汀的效果要好于碳酸鋰;氟西汀組和碳酸鋰組大鼠海馬BDNF表達均顯著高于抑郁模型組，氟西汀組的BDNF表達與對照組無顯著差異，但碳酸鋰組則顯著低于對照組。氟西汀是5-羥色胺再攝取抑制劑 (serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)類抗抑郁藥物的代表藥物，是目前臨床上治療抑郁癥的一線藥物之一，具有良好的抗抑郁作用。以往SSRIs類藥物被認為主要是通過調整突觸間隙5-羥色胺的濃度來起到抗抑郁作用，但近年來人們發現，包括氟西汀在內的SSRIs能夠逆轉慢性應激導致的BDNF的mRNA表達水平下降［13-14］，這與本研究結果是一致的。碳酸鋰作為最早應用于臨床治療的情感穩定劑，是治療急性雙相抑郁障礙的一線藥物，同時也被作為抗抑郁藥物的增效劑用于單相抑郁發作的治療，能夠增強抗抑郁藥物的治療效果。有研究報道碳酸鋰能增加大鼠海馬BDNF水平［15］，但另外的研究則不支持這一結論［16］。本研究結果顯示，碳酸鋰能夠上調大鼠海馬BDNF表達水平，但效果弱于氟西汀，也無法使其回到正常水平，這一結果一方面說明其抗抑郁療效的有限性，同時也提示其作用機制有待于進一步研究。綜合本研究結果，我們推測抗抑郁藥物通過上調海馬BDNF的表達，增強BDNF對神經元的營養、保護作用，可能是抗抑郁藥物發揮療效的重要中間環節。

綜上所述，慢性應激導致海馬BDNF水平的變化可能是抑郁癥發病的內在病理生理機制，抗抑郁藥物對BDNF水平的調控可能是其發揮抗抑郁療效的靶點之一，故提高腦內BDNF水平以增強對神經元損傷的保護也可能對抑郁癥的治療起到積極效果。不同種類的抗抑郁藥物療效不同，他們的作用機制也有差異，聯合應用多種不同機制的抗抑郁藥物治療是否能夠通過他們各自作用機制的特異性影響起到聯合增效作用將是下一步的研究方向。

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