分化抑制因子Id3在散發(fā)性大腸腺癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

馬艷會(huì)，劉揆亮，劉 紅，王滄海，張 穎，吳 靜

堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是細(xì)胞生長過程中重要的調(diào)控因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化等作用。分化抑制因子 (inhibitor of DNA binding/differentiation，Id)蛋白家族包括Id1、Id2、Id3、Id4，屬于HLH蛋白家族，因缺乏與DNA結(jié)合區(qū)域而對(duì)HLH轉(zhuǎn)錄因子起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，具有調(diào)控細(xì)胞定向分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管形成及腫瘤浸潤等作用［1］。Id蛋白家族成員具有相互重疊的作用，同時(shí)也有各自獨(dú)特的生物學(xué)作用。Id1在腫瘤中發(fā)揮的生物學(xué)作用已得到普遍認(rèn)可，但目前國內(nèi)關(guān)于Id3蛋白對(duì)消化道腫瘤尤其是大腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的報(bào)道較少，因此本研究采用免疫組織化學(xué)二步法 (EnVision System)檢測(cè)Id3在正常大腸黏膜組織、大腸腺瘤及散發(fā)性大腸腺癌中的表達(dá)，分析其與各臨床病理特征的相關(guān)性，探討Id3在人散發(fā)性大腸腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院2009年1月—2010年1月臨床資料完整且保存完好的18例患者的正常大腸黏膜組織，30例患者的大腸腺瘤組織，35例患者的散發(fā)性大腸腺癌石蠟標(biāo)本，患者年齡28～73歲，平均48.5歲。患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療及生物免疫治療。

1.2 方法 檢測(cè)采用EnVision System，試劑盒購自丹麥DAKO公司，操作步驟嚴(yán)格按照說明進(jìn)行。兔抗人Id3單克隆抗體 (濃縮型)購自abcam(英國)，產(chǎn)品編號(hào)ab41834。所有標(biāo)本經(jīng)蘇木紫-伊紅 (Hematoxylin-eosin，HE)染色觀察再次證實(shí)其病理性質(zhì)，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)醫(yī)師雙盲讀片，結(jié)果取平均值。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果觀察及判斷標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)Id3蛋白染色片進(jìn)行半定量分析，分值A(chǔ)為染色評(píng)分:無著色計(jì)0分，淺棕黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，深棕黃色計(jì)3分;同時(shí)隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)癌細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，得出細(xì)胞陽性率，為分值B，＜10%計(jì)0分，10% ～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51% ～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。分值A(chǔ)與分值B之和即為該腫瘤細(xì)胞的染色指數(shù)評(píng)分，0～2分定義為陰性表達(dá)，3～7分定義為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用多個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis Test檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料及關(guān)聯(lián)性分析采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Id3在正常大腸黏膜、大腸腺瘤及散發(fā)性大腸腺癌組織中的表達(dá) Id3在正常大腸組織中弱表達(dá)甚至不表達(dá) (見圖1)，在大腸腺瘤組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核 (見圖2)，而在散發(fā)性大腸腺癌組織中除在腫瘤細(xì)胞核中偶有表達(dá)外，主要在胞質(zhì)中表達(dá) (見圖3)。Id3在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、散發(fā)性大腸腺癌組織的陽性率分別為11.1%，70.0%和88.5%，3種組織中陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=20.66，P＜0.01)。

2.2 散發(fā)性大腸腺癌中Id3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Id3與患者性別，年齡，腫瘤浸潤深度、分化程度、大小均無明顯相關(guān)性 (P＞0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性 (P＜0.01，見表1)。

圖1 Id3在正常腸黏膜的表達(dá) (免疫組化，×200倍)Figure 1 The expression of Id3 in normal mucosa

圖2 Id3在大腸腺瘤的陽性表達(dá) (免疫組化，×200倍)Figure 2 The positive expression of Id3 in colonrectal adenoma

圖3 Id3在大腸腺癌的表達(dá) (免疫組化，×200倍)Figure 3 The positive expression of Id3 in colonrectal cancer

3 討論

大腸癌是世界三大最常見腫瘤之一，早期結(jié)直腸癌的術(shù)后5年生存率為91%，但只有39%的大腸癌患者能夠在早期階段得到診斷和治療。大腸癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至臨近器官轉(zhuǎn)移其術(shù)后5年生存率降低為70%，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移其5年生存率則為11%［2］。因此早期診斷大腸癌對(duì)于患者預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。大腸腺瘤是公認(rèn)的癌前病變之一，腺瘤發(fā)展為腺癌的過程被稱為結(jié)直腸腺瘤-癌序列，其涉及癌基因、抑癌基因以及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控。分化抑制因子 Id3，即HLH462，由Christy等［3］在小鼠成纖維細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)。其后相繼報(bào)道Id3在正常組織中不表達(dá)，在成熟細(xì)胞和靜止細(xì)胞中低表達(dá)，高表達(dá)于增殖性細(xì)胞。Id3在多種惡性腫瘤如非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌等高表達(dá)［4-6］。體外實(shí)驗(yàn)表明，Id3-CCR6通路在B細(xì)胞介導(dǎo)的防止早期動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用中發(fā)揮著非常重要的作用［7］。Id3通過調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜瘤易感基因 (retinblastoma，Rb)和E26轉(zhuǎn)化特異性家族轉(zhuǎn)錄因子(Ets)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長，同樣受骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)、腫瘤轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor beta，TGF-beta)、表皮生長因子受體-蛋白激酶B-Smad蛋白 (EGFR-AKT-Smad)等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控［8-10］。

表1 Id3在大腸腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Expression of Id3 in colonrectal cancer and its correlation with clinicopathological features

本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到Id3在正常大腸黏膜組織中弱表達(dá)，與Coppe等［11］報(bào)道一致。大腸腺瘤組織中Id3有較高的表達(dá)，與Wilson等［12］研究提示人大腸腺瘤中無Id的表達(dá)的觀點(diǎn)不同，可能與種族差異、實(shí)驗(yàn)試劑及判斷標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。不同的試劑盒可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，且免疫組織化學(xué)作為半定量實(shí)驗(yàn)方法，其結(jié)果受實(shí)驗(yàn)者主觀判斷的影響。Id1在腸上皮細(xì)胞表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因鼠的后代發(fā)生腺瘤，Id1和Id3在功能上有很多的相似之處，體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道轉(zhuǎn)染Id3基因呈現(xiàn)G2期和S期細(xì)胞明顯增加，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［13］。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者推測(cè)Id3在大腸腺瘤中的較高水平表達(dá)與其促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及分化的原癌基因的生物學(xué)特性有關(guān)，其可能參與腺瘤的發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)大腸腺瘤惡性轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果表明，Id3在散發(fā)性大腸腺癌中高表達(dá)，與國外報(bào)道相似［11］，其主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，也可見于細(xì)胞核中。有研究指出Id3細(xì)胞核陽性是腫瘤發(fā)生的促進(jìn)因素［14］，因此細(xì)胞核中的表達(dá)較細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)顯得更有意義，這也許能夠解釋為什么Id3在大腸腺瘤中主要為細(xì)胞核陽性，而在散發(fā)性大腸腺癌中為細(xì)胞核和 (或)細(xì)胞質(zhì)陽性。因此，筆者認(rèn)為Id3參與了大腸腺癌發(fā)生。

一般情況下，侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是大腸癌患者的主要死亡原因，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是術(shù)后輔助治療的重要依據(jù)，因此了解腫瘤患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況尤為重要。Id3表達(dá)于成熟淋巴細(xì)胞，參與淋巴細(xì)胞功能的正常發(fā)揮，在淋巴系祖細(xì)胞中表達(dá)的Id3能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞成熟。研究發(fā)現(xiàn)Id3-/-基因敲除的小鼠存在體液免疫缺陷，B淋巴細(xì)胞增生缺陷和胸腺細(xì)胞成熟受限［15-16］。有報(bào)道指出將胃癌細(xì)胞中Id3基因敲除后癌灶變小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目減少，腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力下降，并且Id3是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)［17-18］。本研究結(jié)果顯示，Id3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在大腸腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移過程中起促進(jìn)作用。因此Id3可能是判斷大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的一個(gè)潛在的重要指標(biāo)，Id3高表達(dá)可能是大腸癌惡性程度的標(biāo)志物。但本研究只運(yùn)用了免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，存在一定的局限性，是否可預(yù)示大腸癌患者的預(yù)后還需要一步的研究和證實(shí)。Id3在大腸正常黏膜組織中弱表達(dá)，在散發(fā)性大腸腺癌中高表達(dá)，表明其可能成為腫瘤靶向治療的目標(biāo)基因。

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