一株葡萄糖和木糖共發酵高效產乙醇重組運動發酵單胞菌的性能評價

馮全周，李十中，王莉，李天成

清華大學核能與新能源技術研究院新能源所，北京 100084

在能源短缺和環境污染日益嚴重的背景下，世界各國都在積極尋求發展可再生能源。生物質能普遍被認為是一種理想的替代能源，特別是燃料乙醇[1-2]。包括農業和工業廢棄物在內的木質纖維素是自然界中最為豐富的可再生資源，因此是工業化生產燃料乙醇的理想底物[3-4]。纖維素和半纖維素都是碳水化合物的聚合體，可以被水解為單糖。纖維素水解產物為葡萄糖；而半纖維素水解產物較復雜，主要是以木糖和葡萄糖為主的單糖[5]。所有這些水解產物中，葡萄糖和木糖含量占絕大部分[6-7]。因此，葡萄糖和木糖的高效充分轉化是纖維素乙醇生產必須解決的關鍵問題，引起了國內外的廣泛關注。

自然界僅有少數細菌、酵母菌和真菌可發酵木糖產乙醇，但這些天然菌株大多存在乙醇收率低、對水解物中低濃度抑制物敏感、乙醇耐受性低等問題。另一方面，高產乙醇的菌株如釀酒酵母和運動發酵單胞菌等，通常不能利用木糖。為此，人們通過基因工程手段構建出一系列新的重組菌，使其可以發酵木質纖維素水解液中的五碳糖產乙醇[8-13]。但重組菌株發酵速率慢，中間代謝產物木糖醇積累的現象比較嚴重，無法滿足乙醇發酵工業化生產的要求。

運動發酵單胞菌Zymomonas mobilis乙醇發酵性能優良，與目前乙醇發酵使用的釀酒酵母相比，其高溫耐受性好、發酵速度快，有利于節省發酵過程發酵罐冷卻能耗，縮短生產周期[14]。此外，Z. mobilis通過ED途徑進行糖代謝，是目前已知唯一通過ED途徑厭氧代謝的微生物[15]。與釀酒酵母乙醇發酵的EMP不同，ED途徑中每分子葡萄糖只產生一分子 ATP，這一低能態造成較低的細胞產量和更高的乙醇產量，提高了乙醇對糖的收率，有利于降低原料消耗。盡管Z. mobilis只能利用葡萄糖、蔗糖和果糖[16],但該種屬模式菌株基因組測序已經完成，遺傳背景清晰，是通過基因工程操作賦予五碳糖代謝途徑的良好出發菌株，已經取得很多研究進展[10-11,17]。

本實驗室基于Z. mobilis 31821，將木糖異構酶 (xylA)、木酮糖激酶 (xylB)、轉醛醇酶 (talA)和轉酮醇酶 (tktA) 基因通過自行構建的質粒結合在一起，構建了一株可以高效利用木糖發酵產乙醇的重組菌株Z. mobilis TSH01。本文研究了該工程菌的最優發酵條件以及對玉米秸稈稀酸水解液的發酵效果，為其應用于利用木質纖維素水解液發酵產乙醇提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒以及引物

大腸桿菌 DH5α被選為質粒表達的受體菌，E. coli K-12提供tktA、talA、xylA以及xylB基因[18],其培養基為LB，培養條件為100 mg/L氨芐青霉素，37 ℃；Z. mobilis ATCC 29191提供Peno和Pgap啟動子基因[19-20]；Z. mobilis 31821作為宿主菌接收外源基因代謝木糖產乙醇；質粒pMD-18 Simple T和pBBR322用來合成質粒pMTM (表1)。Z. mobilis培養基為RMG (10 g/L酵母粉、2 g/L的KH2PO4以及各20 g/L的葡萄糖)，30 ℃靜置培養。

表1 本實驗所用的菌株和質粒Table 1 Strain and plasmid used in this study

1.2 pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB質粒的構建

克隆策略如圖 1所示，首先，分別以Me-Ori-for和Me-Amp-rev為上、下游引物，從pMD-18 Simple T載體中擴增出氨芐青霉素(Amp) 抗性基因及Ori復制子序列，同時引入幾個酶切位點和EZ-Tn5轉座酶識別的Me序列；再用引物Tet-for和Tet-rev從pBBR322質粒上擴增出四環素 (Tet) 抗性基因。分別將以上兩個PCR產物進行BamHⅠ+NcoⅠ雙酶切，DNA純化后進行連接轉化，抗性篩選出正確的克隆質粒pMTM。以Z. mobilis ATCC 29191基因組DNA為模板，Peno-for-NdeⅠ和 Peno-rev-tktA為上、下游引物，擴增得到 NdeⅠ-Peno-3′片段；以E. coli K-12基因組 DNA為模板，tktA-for、tktA-rev-BglⅡ為上、下游引物，擴增得到5′-tktABgl Ⅱ片段。利用前者3′端和后者5′端的重疊序列 (表 2斜體部分) 進行 overlap PCR，得到NdeⅠ-Peno-tktA-BglⅡ操作子，雙酶切之后插入質粒pMTM之中，得到質粒pMTM-tktA。相同方法，不同引物 (表 2) 得到另外 3個操作子BamHⅠ-Pgap-talA-BamHⅠ、NdeⅠ-Pgap-xylABamHⅠ和XhoⅠ-Peno-xylB-BamHⅠ。BamHⅠ單酶切 BamHⅠ-Pgap-talA-BamHⅠ之后非定向插入質粒 pMTM-tktA，篩選獲得正確的pMTM-talA-tktA質粒。NdeⅠ+BamHⅠ雙酶切NdeⅠ-Pgap-xylA- BamHⅠ后定向插入 pMTM-talA-tktA 質粒，篩選到正確的 pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA質粒。最后一個XhoⅠ-Peno-xylBBamHⅠ操作子經 XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切后定向插入pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA質粒之中，篩選得到最終含有木糖代謝相關的4個基因的質粒：pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB。

1.3 重組菌Z. mobilis TSH01的構建

用 ApaⅠ酶切質粒 pMTM-talA-tktA-PgapxylA-Peno-xylB之后，得到兩端含有 Me序列的目的基因的片段，將其與轉座酶EZ-Tn5混合，室溫反應30~60 min，形成轉座復合體，取1 μL電轉化進入Z. mobilis 31821感受態內，電轉化條件參照文獻[22]。10 g/L的四環素抗性RMG平板篩選，挑取幾個單菌落接種RMGX (20 g/L葡萄糖和20 g/L木糖) 液體培養基中，得到幾株可以代謝木糖產乙醇的重組菌，選取其中一株代謝木糖速率最快的進行下步發酵驗證，并將其命名為Z. mobilis TSH01。

圖1 載體質粒pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB的構建Fig. 1 Construction of pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB.

表2 本實驗所用引物Table 2 Primer used in this study

1.4 發酵操作

取出凍存于?80 ℃冰箱內的 Z. mobilis TSH01，用接種環將其接種于50 mL RMGX培養基中，30 ℃靜置培養1~2 d至OD600為2~3之間，作為一級種子液；取1 mL一級種子液接種于含200 mL培養基的500 mL三角瓶內，30 ℃厭氧靜置培養18 h至OD600約為2，可作為二級種子液。所有發酵實驗均采用二級接種，將200 mL二級種子液在4 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，加50 mL滅菌水使菌體重新懸浮，接種于2 L的發酵罐進行發酵。發酵條件為：120 r/min攪拌，不通空氣進行厭氧發酵，采用 2 mol/L的KOH溶液調節發酵液的pH。

玉米秸稈水解條件：玉米秸稈粉碎后與2%稀硫酸混合，固液比1∶10，121 ℃保溫1 h，過濾，采用CaO過量中和，過濾，調pH至中性，利用真空旋轉蒸發儀濃縮備用。

1.5 分析

發酵液中的乙醇含量用氣相色譜進行定量分析，方法采用內標法，內標物為正丙醇；葡萄糖、木糖、乙酸、甲酸、糠醛用高效液相色譜進行定量分析，色譜柱使用 Aminex HPX-87H column (Bio-Rad USA) 離子交換柱，流動相為0.05 mol/L的H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為40 ℃，采用示差折光檢測器RID-20A (島津公司)，檢測器溫度為40 ℃。

計算公式：

2 結果與分析

2.1 發酵條件的確定

為確定Z. mobilis TSH01的最佳發酵條件，選取40 g/L的葡萄糖和40 g/L的木糖為發酵培養基的碳源，設計兩因子、兩水平的正交試驗，研究溫度 (30 ℃和37 ℃) 和pH值 (5和6) 對發酵結果的影響。表3為發酵驗證結果，較高pH條件下發酵有更高的葡萄糖利用率，而且據報道[22]，當胞內pH降低時，會導致胞內有機酸處于未電離狀態，未電離狀態的有機酸會對發酵產生抑制作用；而且相同溫度下，當pH為6時，無論是木糖利用率還是乙醇收率均比pH 5時要高；當pH同為6時，37 ℃發酵的木糖利用率和乙醇收率也比30 ℃發酵時要高。37 ℃條件下，控制pH為6的發酵具有最大的木糖利用率和乙醇收率，分別為98.5%和94.3%。為得到更高的乙醇收率，因此37 ℃，pH 6被選定為后續發酵條件。

2.2 純糖發酵研究

圖2為發酵培養基中可發酵糖分別為8%葡萄糖、8%木糖、8%葡萄糖和8%木糖時，糖利用以及乙醇生成隨時間的變化趨勢。該圖表明，單一糖組分發酵時，葡萄糖的完全利用時間為25 h，利用速率為3.06g/(L·h) (5~14 h為快速利用期，利用速率為 6.8 g/(L·h))；而木糖需要發酵72 h才能利用完畢 (無快速利用期)，利用速率為1.01 g/(L·h)。混合發酵時，葡萄糖完全利用需要48 h，利用速率為1.41 g/(L·h) (16~36 h為快速利用期，利用速率為2.55 g/(L·h))；木糖發酵72 h后利用完畢，利用速率為1.05 g/(L·h) (32~48 h為快速利用期，利用速率為 2.54 g/(L·h))。單一糖組分發酵時，雖然二者均可以被充分利用，但是Z. mobilis TSH01對木糖的利用速率要明顯低于葡萄糖的利用速率；混合發酵時，由于木糖代謝會產生木糖醇，而木糖醇的存在會抑制菌體生長，從而導致葡萄糖的利用速率降低[23]，在Z. mobilis中，木糖是經由運輸葡萄糖的通道Glf進入細胞內的，當葡萄糖存在時會抑制木糖的吸收，而當葡萄糖下降到低濃度時會減少對木糖轉運的抑制，木糖便借助Glf通道以較快速度進入胞內進行代謝[21]。

表3 不同溫度和pH下Z. mobilis TSH01發酵產乙醇的結果Table 3 Fermentationa results for Z. mobilis TSH01 at different temperature and pH

圖2 不同糖源溶液發酵過程中糖源消耗以及乙醇生成動力學曲線Fig. 2 Fermentation of pure sugar. (A) Fermentation of 8% glucose. (B) Fermentation of 8% xylose. (C) Cofermentation of 8% glucose and 8% xylose.

表4計算并比較了3批發酵的糖利用率和乙醇收率。無論是單一組分發酵，還是混合發酵，糖利用率相差不大；但是單一組分發酵時的乙醇收率要遠小于混合發酵的，木糖為唯一組分時尤為明顯。這一現象的原因包括以下幾方面[23]：1)外源基因導入引起的代謝負擔增加；2) 包括木糖醇、乙酸、乳酸、乙偶姻以及二羥基丙酮等副產物的生成；3) 木糖醇的抑制；而混合發酵引起乙醇收率增加的現象之前也有過報道[24]。根據圖2和表3數據分析的對比結果可以大體推斷：在糖源進入胞內的運轉機制上，葡萄糖和木糖存在一定的競爭；而低濃度的葡萄糖會促進木糖的胞內吸收。所以混合發酵則會提高發酵效率，獲得更高的乙醇收率。

2.3 玉米秸稈水解液發酵分析

作為生產燃料乙醇工程菌的目標發酵底物，木質纖維素原料的水解液成分復雜，包括一系列的糖分 (主要為葡萄糖和木糖) 和乙酸以及呋喃衍生物等抑制物。本實驗室采用工業中玉米秸稈的酸解工藝[25]得到水解液，研究了 Z. mobilis TSH01對玉米秸稈稀酸水解液的發酵效果。所制備玉米秸稈水解液中的成分如表5所示。

2.3.1 水解液發酵結果

將得到的稀酸水解液過濾中和后進行濃縮，補加葡萄糖使其與木糖濃度大體一致，加入10 g/L酵母粉和2 g/L的KH2PO4，高溫消毒后作為發酵培養基。發酵結果如圖3所示，發酵24 h葡萄糖基本消耗完全；72 h時木糖利用率為92.3%；以72 h為截點，計算出乙醇代謝收率為91.5%。發酵0 h取樣，測得乙酸、甲酸和糠醛的濃度分別為10.5 g/L、1.5 g/L和1.1 g/L；此外，隨著發酵進行過程上述3種物質濃度均會逐漸減低，前兩者的濃度降低與加堿有關系，而后者濃度降低是因為菌體發酵過程中被代謝掉了。對比純糖發酵實驗，普通稀酸水解液中所含的抑制物質對發酵影響不大，因此說明，Z. mobilis TSH01對普通稀酸水解液中的抑制物 (主要為10 g/L的乙酸) 具有良好的耐受性。

表4 Z. mobilis TSH01純糖發酵產乙醇的結果Table 4 Fermentation results for Z. mobilis TSH01 of pure suger

表5 玉米秸稈稀酸水解液成分Table 5 Components of corn stover hydrolysate

圖3 玉米秸稈稀酸水解液發酵Fig. 3 Fermentation of corn stover hydrolysate.

2.3.2 添加成分對發酵的影響

圖4 添加成分對玉米秸稈水解液發酵的影響Fig. 4 Effect of corn stover hydrolysate fermentation by additional components. (A) Without yeast extract and KH2PO4. (B) With KH2PO4 but yeast extract.

考慮到成本因素，木質纖維素水解液發酵產乙醇過程應該是添加物質越少越好，實驗中除調控pH用KOH之外，外源添加物只有酵母粉和KH2PO4，于是我們通過發酵試驗驗證這兩者對糖利用和乙醇收率的影響 (圖4)。A組實驗為不添加酵母粉和KH2PO4情況下，給水解液補充葡萄糖至濃度和木糖基本相當，滅菌后調控pH進行發酵。發酵72 h后，葡萄糖和木糖利用率分別為98%和68.4%；乙醇代謝收率為84.1%。B組實驗為添加KH2PO4但不添加酵母粉情況下，后續操作發酵和A組實驗一樣。發酵72 h后，葡萄糖和木糖利用率分別為98%和94.4%；乙醇代謝收率為94.5%。B組實驗結果表明，酵母粉對糖利用率和乙醇收率基本上沒有任何影響。再結合A組實驗結果，可以得出結論：KH2PO4對混合發酵木糖利用率和乙醇收率的提高有明顯的促進作用，因為調控pH用的是KOH，發酵液中已經存在K+，所以提升發酵效果的應該是PO43?、HPO42?或者H2PO4?，此結論需要進一步驗證。

3 結論

通過加強啟動子對木糖代謝產乙醇基因的調控，使每個基因均處于強啟動子調控之下，避免單一或者幾個蛋白對乙醇代謝途徑的限制，構建了一株共發酵葡萄糖和木糖性能良好的基因工程菌Z. mobilis TSH01，可同時高效利用葡萄糖和木糖產乙醇。Z. mobilis TSH01的最優發酵條件為添加0.2% K2HPO4、pH 6.0、37 ℃、厭氧發酵。單一糖溶液發酵時，葡萄糖利用速率很高，可以達到3.06 g/(L·h)，而木糖利用速率相對較低，為1.01 g/(L·h)；當二者共發酵時，葡萄糖利用速率降低，而木糖利用速率有所提高，而且當葡萄糖濃度降低到一定值后木糖出現一個快速消耗階段，該結果表明，Z. mobilis TSH01代謝產乙醇的途徑中，葡萄糖和木糖在轉運機制上存在競爭關系，而低濃度的葡萄糖會減少對木糖吸收利用的抑制。當混合糖濃度為16% (1∶1)，葡萄糖和木糖的利用率分別為98.5%和97.4%，乙醇代謝收率高達94.9%。其對玉米秸稈稀酸水解液72 h的發酵結果為：葡萄糖和木糖的利用率分別為100%和92.3%，乙醇代謝收率為91.5%。而且KH2PO4對發酵過程中木糖的利用以及乙醇收率提高有明顯的促進作用。

Z. mobilis TSH01對玉米秸稈稀酸水解液中的抑制物具有良好的耐受性，而且發酵產乙醇效率很高；發酵環境為厭氧環境，無需攪拌，可減低纖維素乙醇工業化生產成本，具有很好的工業化應用前景。

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