茶尺蠖核型多角體病毒多角體蛋白單克隆抗體的制備

杜軍利，張傳溪，付建玉，陳正賢，肖強

1 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

2 浙江大學昆蟲科學研究所，浙江 杭州 310058

3 甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070

茶尺蠖Ectropis obliqua Prout屬鱗翅目尺蛾科，是我國主要茶樹害蟲之一，廣泛分布于長江中下游茶區，其中浙江、江蘇、安徽3省發生尤為嚴重。其幼蟲咬食嫩葉和芽頭，嚴重發生時常將整片茶園茶樹啃成光桿，對茶葉生產影響大。

茶尺蠖核型多角體病毒 (Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EoNPV) 于1977年在我國首次發現[1]，屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬。EoNPV是自然條件下控制茶尺蠖種群的主要病原性天敵因子，它通過幼蟲取食后侵入蟲體并迅速增殖，使其感染發病而死亡，進而在種群中造成病毒流行病。我國較早開展了EoNPV的生物學及應用基礎研究，目前該病毒制劑已獲批農藥登記許可，廣泛應用于浙江省及周邊省區茶園。傳統的EoNPV的檢測依賴LT50和LC50兩個生物測定參數；作者前期研究利用熒光定量 PCR方法測定茶尺蠖核型多角體病毒拷貝數，為病毒的深入研究和病毒制劑的定量檢測提供了方法依據[2]；進一步研究建立快速定性、定量檢測EoNPV的技術對茶園昆蟲病毒研發與大面積推廣應用具有重要的作用。本研究通過制備獲得EoNPV的單克隆抗體，該抗體能特異地與EoNPV病毒粒子蛋白結合，并建立了基于此單抗的ELISA檢測方法，從而為EoNPV的準確快速檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠及其飼料購自上海醫科大學；茶尺蠖野生型種群采自中國農業科學院茶葉所試驗茶園，并經室內繼代飼養；茶尺蠖核型多角體病毒 (EoNPV) 由中國農業科學院茶葉研究所保存。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧物酶標記的山羊抗鼠為 Sigma公司產品；RPMI-1640、HAT、HT培養基、PEG6000購自Gibco公司；牛血清蛋白 (BSA) 購自杭州四季青生物工程材料有限公司；其他常規試劑均為國產分析純。小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0引自浙江大學農業與生物技術學院生物技術研究所，用高糖的DMEM培養基傳代培養。

1.2 EoNPV病毒粒子的分離純化

收集感染EoNPV而死亡的茶尺蠖幼蟲作為試蟲，將其磨碎；用5層粗棉布過濾其中較大顆粒后，反復3 000~5 000 r/min離心，用1×PBS反復洗滌純化的多角體，至乳白色為止；加入適量新配制的裂解液0.1 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaCl (pH 10.3) 裂解多角體1~2 h；用50%的HCl中和堿液，3 000 r/min離心5 min，去除其中未裂解的多角體；在160 000 r/min、1.5 h超速離心，沉淀EoNPV病毒粒子；使用PBS懸浮純化的病毒粒子，存于4 ℃冰箱待用[3-4]。

1.3 小鼠免疫

將經超速離心純化后的茶尺蠖核型多角體病毒粒子作為抗原與等量福氏完全佐劑充分混合，經皮下多點注射BALB/c小鼠，每只200 μL，間隔14 d用含等量的福氏不完全佐劑的蛋白抗原相同劑量作第2、3次免疫，14 d后，腹腔注射不加佐劑的蛋白抗原，每只200 μL，3 d后取脾細胞用于細胞融合[5-7]。

1.4 細胞融合和克隆

在加強免疫后3 d左右獲取小鼠脾細胞，將其與正處于對數生長期的骨髓瘤細胞進行融合，每次融合后，將細胞接種于96孔培養板，用含HAT的1640完全培養基選擇培養10 d左右，然后將HAT改為HT培養1周[8-9]。待細胞長至顯微鏡視野的1/4，取培養上清用ELISA法檢測抗體，將原免疫用抗原 EoNPV病毒粒子稀釋100倍作為包被抗原[10-11]，使用間接 ELISA方法檢測獲得陽性細胞；再以陰性對照 (包括 Bt生物制劑、菜青蟲顆粒體病毒) 作為包被抗原對所選陽性細胞進行再篩選，最終獲得的陽性細胞株只對 EoNPV病毒多角體蛋白表現陽性反應；選擇最終的陽性細胞以有限稀釋法進行克隆[12-14]。

1.5 陽性單克隆抗體細胞株的篩選

對克隆后檢測為陽性的單克隆細胞株進行規律傳代培養，并且每一代檢測它們的抗體分泌情況，最終獲得穩定分泌抗體的EoNPV單克隆抗體細胞株。

1.6 小鼠腹水抗體制備及效價測定

將最后篩選出的陽性單克隆雜交瘤細胞株進行擴大培養，并向小鼠腹部注射降植烷。1周后，使用生理鹽水將細胞沉淀懸浮，接種于小鼠腹腔，待小鼠腹腔明顯鼓脹，抽取腹水測定其抗體效價并保存于?20 ℃，用于檢測[15]。

培養上清或腹水經稀釋后，加到包被原包被的酶標板中，孵育、洗滌后，再加入 HRP標記的羊抗鼠IgG，底物顯色。陽性對照為小鼠陽性血清，同時分別以同等稀釋的Sp2/0培養上清，或無免疫小鼠血清為陰性對照，空白對照為PBS[16]。

1.7 單抗的穩定性

將分泌抗體的雜交瘤細胞株體外連續傳代，或置液氮中凍存 3個月后復蘇，用間接 ELISA方法檢查該細胞株分泌單抗的穩定性[17]。

1.8 ph基因的克隆與原核表達

根據 EoNPV 基因組序列 (GenBank Accession No. NC_008586.1) 的ph基因[18-21]，設計了一對特異性引物，EoNPV ph F：5'-GGATCCatgtatactcgttaca-3'和 EoNPV ph R：5'-CTCGAGttaatacgcaggtcct-3'，擴增ph基因，PCR反應采用25 μL體系，PCR擴增程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；30個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，預測片段大小約741 bp。

擴增的產物克隆至pMD18-T克隆載體，連接產物轉化TG1感受態細胞，提取質粒，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的表達載體質粒pGEX-4T2，提取質粒并通過 PCR鑒定，最后得到與谷胱甘肽融合表達的載體質粒pGEX- 4T-2-ph。

將 pGEX-4T-2-ph轉化至表達菌株 E. coli BL21 (DE3) 中表達，挑取單菌落于37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養過夜。次日轉接5%培養液于新鮮5 mL LB培養基中，培養至OD600為0.4~0.6 (2~3 h)，加入IPTG，37 ℃繼續誘導培養5~8 h，分別收集菌體，用適量PBS稀釋后，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴5 min后，12 000 r/min離心10 min去除不溶物，取10 μL進行SDS-PAGE檢測及Western blotting分析。同時，以BL21菌液和轉化pGEX-4T2的誘導菌液作為對照。

1.9 Western blotting分析

多角體蛋白 (Polyhedrin，PH)、EoNPV病毒粒子、PGEX-4T-2載體蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后，分離膠及與膠相同大小的PVDF膜和3層濾紙在轉移緩沖液中平衡15~20 min；將3層濾紙、分離膠、PVDF膜和3層濾紙依次裝入轉移夾中，以Bio-Rad轉印槽半干轉移，轉移條件為恒電壓15V 15 min；PVDF膜用封閉液 (4%脫脂奶粉) 室溫封閉 1 h；加入小鼠腹水于洗滌液中稀釋1 000倍，室溫反應1 h或4 ℃反應過夜；PBST洗滌3~5次，每次5 min；HRP酶標的羊抗鼠二抗于洗滌液中室溫反應1 h；洗滌3~5次，每次5 min；加入10 mL HRP反應底物DAB溶液覆蓋于PVDF膜上顯色，待陽性條帶顯示后，用ddH2O終止反應[22-24]。

1.10 最適工作濃度的確定

把濃度為1.5 g/L的純化病毒從1∶100開始依次倍比稀釋，稀釋至1∶204 800。由左至右依次加入96孔板，置于4℃包被過夜或者37 ℃包被2 h。使用間接ELISA進行檢測，當需加入一抗時，將單克隆抗體從1∶1 500開始依次倍比稀釋，稀釋至 1∶192 000，由上而下依次加入 96孔板。顯色后置于酶標儀上讀板[25-26]。

1.11 檢測靈敏度的測定

感染EoNPV的蟲體汁液按1∶10~1∶327 680倍比稀釋，把純化后的EoNPV病毒粒子 (1.5 g/L)使用包被液從1∶10~1∶5 120倍比稀釋后，分別作為抗原，設置3個重復，并以未感染病毒的茶尺蠖蟲體汁液作為陰性對照。再將上述稀釋液加入反應孔中，4 ℃包被過夜，使用間接ELISA方法進行靈敏度檢測[27-28]。

1.12 樣品檢測

獲取涂抹EoNPV的葉片飼喂的茶尺蠖和健康葉片飼喂茶尺蠖各 30頭，稱取蟲體重量。磨碎后，根據體重分別稀釋10倍，進行ELISA檢測。用提純的EoNPV作陽性對照，包被液作陰性對照。

2 結果與分析

2.1 雜交瘤細胞株的建立

雜交瘤細胞培養上清的間接 ELISA的檢測結果表明：以細胞培養上清對EoNPV抗原OD492值，與正常BALB/c小鼠血清對EoNPV抗原的OD450值之比大于 2.1，且雜交瘤細胞上清對 Bt的檢測結果為陰性，判為陽性雜交瘤細胞。經過篩選和有限稀釋法亞克隆，獲得了1株陽性雜交瘤細胞，命名為7D3。

2.2 單抗的穩定性

經過連續傳代凍存2個月后，將雜交瘤細胞復蘇，該細胞株仍能分泌抗體，間接 ELISA檢測效價和原來效價無差別，表明該雜交瘤細胞分泌抗體的穩定性較好。

2.3 雜交瘤細胞腹水效價測定

把雜交瘤細胞注射進入小鼠腹部后，獲得該雜交瘤細胞的腹水。腹水先稀釋100倍，而后再依次倍比系列稀釋，最后使用間接 ELISA法測定OD450值，同時設立陽性陰性血清對照。雜交瘤細胞腹水的OD450值之比大于2.1時的最大稀釋度即為其 ELISA效價，經檢測得知該雜交瘤細胞的效價為106(圖1)。

圖1 細胞株7D3的抗體效價測定Fig. 1 The titres of ascitic of cell line 7D3.

2.4 用制備的單抗對病毒進行 Western blotting檢測

把EoNPV進行SDS-PAGE后轉移到PVDF膜，用制備的單抗為一抗，進行Western blotting檢測。結果顯示，在約28 kDa處有強陽性條帶(圖2)，與SDS-PAGE上出現的多角體蛋白條帶大小相近，推測所獲得的單抗應是一種多角體蛋白 (PH蛋白) 單抗。

2.5 ph基因原核表達質粒的構建

為了確認獲得的單抗是一種多角體蛋白單抗，進一步克隆表達多角體蛋白基因ph。首先用引物ph F、ph R從EoNPV基因組DNA中擴增出長度741 bp的ph基因，連接至pMD18-T克隆載體，測序結果與預期結果相符，使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，回收片段，將其定向克隆至由 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切過的 pGEX-4T-2載體，PCR鑒定，結果顯示獲得表達質粒pGEX-4T-2-ph (圖3)。

圖2 EoNPV的Western blotting分析Fig. 2 Western blotting analysis of EoNPV. M: protein marker; 1: virus of EoNPV.

圖3 ph基因原核表達質粒的構建Fig. 3 Construction of ph gene prokaryotic expression-vector plasmid. 1: PCR product of ph gene; 2: recombinant pMD18-T vector was identified by double enzyme digestion with BamH I and Xho I; 3: pGEX-4T-2-ph was identified by PCR.

2.6 ph基因的表達和Western blotting分析

表達質粒 pGEX-4T-2-ph轉化大腸桿菌BL21，收集經IPTG誘導的菌體進行SDS-PAGE檢測，結果表明，大約54 kDa處有明顯的特異性條帶 (圖4)，與GST和polyhedrin融合表達產物大小相符。然后使用已制備的EoNPV的單抗進行 Western blotting分析，發現該抗體與EoNPV病毒粒子和 ph基因原核表達蛋白均有特異性條帶，而且蛋白大小與預期一致，同時顯示陽性的還有一條分子量約為 40 kDa的條帶，可能是ph基因不完全表達產物或表達產物的降解產物。而作為陰性對照的空 PGEX-4T-2載體表達產物與雜交瘤細胞的腹水無明顯的條帶出現 (圖4)。

2.7 工作濃度的確定

檢測用的EoNPV單抗腹水倍比稀釋后進行間接ELISA檢測，單抗在1∶192 000范圍內均可用于檢測，與在此范圍內的陰性對照的OD值非常低，P/N值大于＞8，但是在實際應用時要求有較高的靈敏度，因此我們選擇單抗腹水稀釋倍數為1∶6 000作為間接ELISA的最適工作濃度，另外二抗的最適濃度為1∶5 000。

2.8 檢測靈敏度的確定

把感染病毒的病蟲體液倍比稀釋后經間接ELISA檢測，從1∶10到1∶20 480都是較理想的稀釋度，當稀釋度為1∶10 240時，P/N＜2.1，所以其檢測極限為1∶5 120。純化后的EoNPV粒子 (1.5 g/L) 及未感染的茶尺蠖蟲體液倍比稀釋后，進行間接 ELISA檢測，7D3細胞株所得單抗對純化的EoNPV粒子有較高的靈敏度，靈敏度可達到6 ng (圖5)。由此可建立了一條標準曲線，方程為y=?0.4144x+3.0742 (R2=0.9929，圖6)。該標準曲線可計算未知樣品的稀釋倍數 x，病毒濃度 (g/L) 即為1.5÷ (2x×100)。一般實驗中都以多角體個數為病毒的單位，即 PIB/mL，通過實驗得知多角體數量與g/L的換算關系為1 g/L=2.75×108PIB/mL。因此在使用圖6所示公式計算出病毒的濃度后，再換算成多角體個數。

圖4 SDS-PAGE和Western blotting分析結果Fig. 4 SDS-PAGE and Western blotting analysis. M: protein molecular weight marker; 1,2: SDS-PAGE analysis of ph protein, PGEX-4T-2 vector, respectively; 3,4: Western blotting analysis of GST-ph fusion protein, PGEX-4T-2 vector, respectively.

圖5 細胞株7D3對純病毒的檢測Fig. 5 Detection of the purified EoNPV with cell line 7D3.

圖6 不同濃度梯度的純化病毒OD450值的標準曲線Fig 6 Standard curve of OD450 value with different concentration of purified EoNPV.

2.9 樣品檢測

通過間接ELISA檢測得知，使用EoNPV的葉片飼喂的茶尺蠖檢測率為100%，另外用血清計數法對其進行觀察，表明飼喂EoNPV的葉片的茶尺蠖體內確含有EoNPV病毒，而飼喂健康葉片的茶尺蠖檢測率為0，使用血清計數法檢測未發現EoNPV的多角體。因此間接ELISA方法與血清計數法檢出陽性率一致。

3 討論

單克隆抗體技術是當今生物學領域中一次重大技術突破，雜交瘤細胞既具有大量無限生長的特性，又具有合成和分泌抗體的能力，是由識別單一抗原決定簇的細胞克隆所產生的均一性抗體。與常規多克隆抗體相比，由雜交瘤技術制備的單克隆抗體，具有特異性強，靈敏度高、質地均一，可以大量生產等優點，因此在近20年內得到了快速地發展，而且在生物科學的許多領域得到了廣泛的應用，但是用雜交瘤技術制備單抗耗時長，成本也較高，又難獲得對某些半抗原和抗原的抗體，因而阻礙了單抗技術應用的進一步發展。在植保科研領域，國內外先后研制出多種植物病毒、真菌、細菌和昆蟲病毒等病原微生物的單克隆抗體，并初步開始相關的應用研究，突顯出其廣闊的應用前景[29]。1982年德國的Robert等首次研制出5株分泌抗苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒 (AcNPV) 單抗雜交瘤細胞株[30]，接著加拿大的Hohman等研制出34株抗AcNPV單克隆抗體[31]。隨后10年來，相繼研發出一些昆蟲病毒單克隆抗體。雖然與其他動物病毒相比，昆蟲病毒單克隆抗體應用研究起步比較晚，但已初步顯示出廣泛的應用前景，因此研制昆蟲病毒單克隆抗體診斷試劑逐漸取代常規的抗血清已成為大勢所趨。

單抗的專一性與選用的抗原有密切的關系，在NPV中多角體蛋白量最大，制備方便，抗原性也很強。在本試驗中，利用細胞融合技術制備了能穩定分泌抗EoNPV多角體蛋白的雜交瘤細胞株 (7D3)，該細胞株靈敏度較高，效價為105，能夠檢測EoNPV生物制劑中是否含有EoNPV的多角體，由此建立了快速檢測的 ELISA檢測方法。由于自然界存在許多種桿狀病毒，EoNPV多角體蛋白與其他多種NPV的多角體基因同源性比較高[3]，例如茶刺蛾核型多角體病毒、茶毛蟲核型多角體病毒、家蠶核型多角體病毒等桿狀病毒等，所制備的抗體可能對含有多角體蛋白的其它桿狀病毒也能特異性結合，因此有必要作進一步研究，以明確目前所篩選出的是否是只對EoNPV專一性結合的單克隆抗體，進而建立更加完善的定性定量檢測EoNPV的方法。

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