應用于組織工程支架制備的電紡技術

李好義，劉勇，何雪濤，丁玉梅，閻華，謝鵬程，楊衛民

北京化工大學機電工程學院，北京 100029

應用于組織工程支架制備的電紡技術

李好義，劉勇，何雪濤，丁玉梅，閻華，謝鵬程，楊衛民

北京化工大學機電工程學院，北京 100029

組織工程技術為修復病損的組織和器官提供了一種新的途徑，在組織工程中，細胞支架起著支撐細胞生長、引導組織再生、控制組織結構和釋放活性因子等作用。針對電紡技術的新發展和細胞支架的新理念，綜述了國內外利用電紡技術制備細胞支架的工藝條件、制備方法、組織細胞培養等方面的研究進展，并結合作者所在研究團隊的研究工作提出了對未來電紡技術在組織工程中應用的研究重點和發展方向的認識。

組織工程，電紡技術，細胞支架

細胞支架必須具備以下特征：1) 支架和組織有很好的相容性，能創造良好的擬細胞外基質(ECM) 環境；2) 支架材料具有可降解性，且降解產物對細胞 pH值的影響和毒性在最小范圍內，同時支架的降解速度可控，能和細胞的增殖過程相一致；3) 針對不同組織要求，保證具備相應的力學性能；4) 優化的支架形態和微納拓撲結構，以及優化的孔隙率、支架孔徑、纖維直徑、纖維取向、三維形態等將為細胞提供有利的生長條件；5) 具有暫存和緩慢釋放生物活性物質的能力。

目前用于組織工程支架的傳統制備方法包括氣體泡沫法、相分離法、冷凍干燥法、纖維黏結、溶劑澆鑄/粒子瀝濾、乳化/凍干等，這些方法雖然一次成型簡便，但缺點在于孔隙率小、強度差、支架參數 (孔隙率、孔尺寸、空間取向等)的可控性差[2-4]。新的制備方法也在大量涌現，比如采用飛秒激光加工熱塑性聚酯材料，成功制備出了血管支架[5]，但是其成本高、效率低；快速成形技術發展迅速，實現了組織工程支架內部多孔結構與復雜外形的精確控制[6]，但所制備的支架孔隙率偏低，通常小于80%[7]。

電紡是一種高效低耗的納米纖維制備技術，其原理是在裝有聚合物溶液或熔體的腔體噴頭和接收裝置之間施加幾千到幾萬伏的高壓靜電，使溶液或熔體在高壓靜電場作用下產生與表面張力相反的電場力，驅使溶液或熔體在毛細管末端拉伸成一個泰勒錐，當電場力足夠大時，聚合物液滴可克服表面張力形成噴射細流[8]。電紡最大的特點是可以制備具有高孔隙率、高比表面積的納米纖維拓撲結構，其參數的靈活可控為細胞支架的制備提供了充分發揮的空間。

電紡分為溶液電紡法和熔體電紡法。溶液電紡法是利用高分子溶液進行靜電紡絲的方法，由于多種細胞支架材料可以較好地分散到相應溶劑中，濃度的控制較易，因此，電紡在組織工程支架方面的應用比較普遍。熔體電紡中加熱溫度不易實現精確控制，熔體粘度大，研究相對較少，但其特點是不使用溶劑，省去了諸多工藝，避免了殘留溶劑的毒性，在組織工程中有很大的應用前景[9]。

1 針對支架特性進行電紡所需的工藝條件

1.1 針對支架特性調控纖維結構、形貌和性能

目前可以進行電紡的組織工程支架材料分為天然生物材料和人工合成材料，其中天然生物材料主要為膠原蛋白 (Collagen)[10]、明膠(Gelatine)[11]、蠶絲 (Nature Silk)、蜘蛛絲 (Spider Silk)[12-13]、幾丁質 (Chitin) 及其衍生物、纖維蛋白 (Fibrin)[14]等；合成材料主要是一些生物可降解材料如聚乳酸 (PLA)[15]、聚乙醇酸 (PGA)、聚乳酸-羥乙酸、聚己內酯 (PCL)[16]以及可作為血管支架的聚氨酯 (PU) 等。常用溶劑主要是鹽溶液、氯仿 (Chloroform)、乙醇、六氟異丙烯(HFIP)、六氟丙烷 (HFP)、四氫呋喃 (THF)、二氯甲烷 (DCM) 等。為了增加纖維的韌性、強度，研究者利用了一些復合材料或共聚物進行電紡，取得了很好的效果：Moroni等[17]利用聚對苯二甲酸丁二醇脂和聚環氧乙烷 (PEOT/PBT) 的混合溶液電紡的納米纖維用于人間葉干細胞的培養，效果顯著；Zong等[18]利用聚丙交酯 (PLLA)和聚乙交酯 (Poly (glycolic acid)) 的共聚物聚丙交酯乙交酯 (PLGA) 電紡獲得支架，并對其進行拉伸取向，用于心臟組織工程的研究。

1.2 支架纖維直徑的控制

在組織工程中，不同組織的功能和細胞大小不同，所對應的最佳支架纖維直徑也不同，因此，利用合理的紡絲工藝獲得不同纖維直徑的細胞支架成為必然。電紡中紡絲溶液的粘度對紡絲直徑起著至關重要的作用，溶液的粘度一般取決于聚合物分子量和其配比濃度；熔體電紡的纖度主要取決于熔體的表觀粘度，作者所在的研究小組針對不同的材料其熔體粘度對溫度和剪切的敏感性不同，通過對不同材料熔融溫度和剪切作用的精確控制可以獲得目標直徑的纖維[19]。一般情況下，溶液或熔體粘度越高，獲得的纖維直徑越大；溶液或熔體的流動速率越大，獲得的纖維直徑就越大，但是當流動速率超過一定值，紡絲將無法進行；電場強度對纖維直徑的影響也不可忽視，在一定范圍內，電場強度越大，獲得的纖維越細，但是當超過臨界值時纖維甚至會變粗[20]。紡絲針頭的孔徑也對纖維直徑有一定影響，對于一般的溶液紡絲，針頭孔徑越大，制備的纖維直徑越小，直徑分布越趨于一致[17]。

1.3 支架孔隙率及孔徑的控制

組織工程支架的孔隙率和孔徑是非常重要的參數，對于細胞的生長、養分的吸收、代謝排出以及信息的傳導具有重要意義[8]。電紡技術一般可以提供孔隙率90%左右的支架，孔徑一般小于100 μm[21]，這樣的孔徑可能不利于較大的細胞的生長和滲透，因此可以結合其他的纖維制備工藝制備復合支架。對于一般的溶液電紡，其孔隙率和孔徑取決于其纖維直徑，隨著直徑的增加，孔隙率和孔徑也相應增加，但是纖維比強度相應降低[22]。但是也有研究表明，這種影響并不明顯[23]。電紡在獲得任意強度、孔隙率和適度孔徑的纖維支架方面的靈活性是不可否認的，但還需要大量的實驗進一步明確和細化其工藝。

1.4 支架纖維表面微孔的控制

溶液電紡由于溶劑的揮發一般會在纖維表面形成納米級微孔。同樣直徑的電紡納米纖維，具有表面納米微孔結構的纖維具有更高的細胞活力，細胞不再聚集生長，取而代之的是分散的細胞，微孔也激發了不同的生物反饋，制備過程中溶劑的沸點以及聚合物溶液濃度及氣隙都將對微孔孔徑的存在及其大小產生影響[17]。

1.5 支架物理性能的控制

組織支架的物理性能對細胞的生長具有關鍵作用，比如肌腱組織支架需要一定的力學拉伸性能，而人工血管則要求具有與宿主血管相近的強度，同時，還要求細胞支架具有一定的時間穩定性，即隨著支架的降解，其機械支撐性能必須滿足一定的要求，這是一個動態的機械性能變化要求。

目前電紡絲主要通過5個方面的改進來逐漸滿足支架在機械性能方面的要求：

1) 支架材料的改進：從單一的高分子向化學性能、物理性能及生物性能俱佳的共混體系和共聚物發展，比如PLA是難結晶易碎材料，而PCL是半結晶材料，有彈性，它們的共聚物具有一定的機械性能，根據不同的復合比例，可以得到不同程度的機械性能；PGA只溶解于高氟代有機溶劑如FHIP等，由于單純的PGA機械強度較差，而且脆性大，難于加工，因此人們常通過共聚得到PLGA以改善材料的機械性能和降解性能，如今這類材料已經在軟骨、骨、神經組織工程以及人工肝、人工膀胱等領域得到了廣泛的應用[24]。

2) 電紡條件的精確控制如溶劑的選擇、溶液濃度、熔體電紡的熔融溫度、加熱時間、電極間距、針頭內徑等。

3) 對支架的后處理可以有效地提高機械強度，研究發現，紡絲過程中的纖維取向對強度影響很大，因此，在紡絲過程中，利用不同的纖維取向方法提高纖維強度，是簡單易行和廣泛使用的方法[18]，還有些研究者利用乙醇溶液對纖維進行后處理，增加了纖維的強度。

4) 電紡絲結合其他微米級纖維制備方法，制備多層復合支架，利用粗纖維支架作為主要支撐結構，電紡支架作為功能支架。

5) 利用同軸電紡技術，將力學性能差的材料或不易電紡的材料作為芯材，力學性能好的作為殼材，通過降解速度的控制，使得核殼結構發揮功能。

2 電紡纖維細胞支架用于組織細胞培養的研究

2.1 電紡纖維細胞支架用于軟骨及骨組織工程

軟骨及骨組織其特殊的組織結構、生物學和生物力學特點決定了軟骨及骨修復的復雜性。支架一直是該組織工程的研究重點，美國塔夫斯大學的 Li等[25]利用絲素蛋白、骨形態發生蛋白、羥磷灰石納米顆粒制備了纖維支架，利用人骨骨髓間葉干細胞通過31 d的培養，發現骨形態發生蛋白的后處理有助于更多鈣的沉積并促進了骨細胞遺傳物質中特異性標記物的轉錄水平，羥磷灰石納米顆粒的加入促進了骨的形成。瑞典的Thorvaldsson等[26]通過電紡的方法將聚己內酯的納米纖維纏繞到了聚乳酸微米纖維上，獲得了孔隙率達95%以上的支架，研究了可控的孔隙率對細胞浸潤的作用，研究顯示支架空隙率對細胞浸潤具有很大的影響，孔隙率越大，浸潤效果越好，進一步證明了該制備方法的優勢。Lee[27]的博士論文研究了兩種復合電紡絲材料的性能，用于醫治關節炎癥患者，一種是含有鹽孔的燒結電紡纖維，該支架降低了電紡材料的機械性能，同時改善了細胞向支架內部滲透的能力；另外在支架中加入了熱固的水凝膠來復制關節軟骨蛋白聚糖的表達功能。

2.2 電紡纖維細胞支架用于血管組織培養

血管的手術替代和心臟搭橋手術在心血管疾病的治療中具有重要地位，目前聚對苯二甲酸乙二醇酯或者膨體聚四氟乙烯的合成血管廣泛用于大直徑的血管嫁接，但是小于6 mm的血管的移植一直以來由于其易堵、易成栓、易內膜增生等原因，成為一個較復雜的難題。北卡羅萊納州大學的 Chung等[28]集成了熔融紡絲和靜電紡絲方法利用PCLA共聚體制備了直徑為5 mm，孔隙率大于75%的血管組織支架，該支架生物可吸收且具有彈性，經測定該支架機械性能超過了天然動脈的橫向拉伸值，發現細胞培養初期，細胞增殖較慢，后期隨著時間增值速度增加 (圖1)，利用兩種方法制備的雙層管狀結構，其包括超細的電紡纖維和粗的熔融紡制纖維，該結構模擬了真正的血管結構，有利于差異性內層和平滑肌肉組織層的形成。

圖1 細胞在PLCL支架上培養7 d后細胞粘連的電鏡圖[28]Fig. 1 SEM photomicrographs of cell attachment on PLCL scaffolds after 7 days of culture[28].

2.3 電紡纖維細胞支架用于神經組織培養

早老性癡呆癥和帕金森綜合癥作為典型的神經變性病，通常是由不溶性絲狀纖維的堆積、聚集所引起的早期軸突功能紊亂和病變所致。電紡網格已經成為最有希望應用于神經纖維的修復材料，只要選擇合適的神經細胞類型，獲得適當的三維結構就可以完全恢復神經功能[29]。目前主要研究內容包括：各種纖維取向和纖維尺寸對神經細胞的影響，Yang等通過和微米尺寸纖維相比，證實了納米尺寸的PLLA能增強新生鼠小腦 C17.2干細胞的增殖[30]；將一些化學物質加入纖維用來改善細胞功能，如使用乙二胺處理的 PCL電紡纖維增加了其親水性，這樣促進了細胞粘連，但不影響小鼠腦神經干細胞[31]；增加電紡支架的電活性來改善纖維取向、增強細胞功能，如在PLGA網格中涂覆一層聚吡咯提供電刺激來促進和引導神經細胞軸突的延展。

2.4 電紡纖維細胞支架用于心臟組織的構建研究

紐約州立大學的Zong等[18]利用電紡支架用于心臟組織結構的培養研究，通過電紡制備了生物可降解的PLGA膜，通過后處理使纖維呈現各向異性，使用含有不同含量聚乙交脂的亞微米纖維對原發性心肌細胞培養了類心臟組織結構，研究發現，可以通過纖維微納表面的化學和幾何設計獲得預設的心臟組織和功能，發現心肌細胞沿著纖維取向方向生長的特性 (圖2)，在快速降解及親水性纖維上細胞密度較低。

圖2 PLLA預設取向纖維上心肌細胞激光掃描共聚焦顯微鏡圖[18]Fig. 2 CLSM images of cardiac myocytes on predefned oriented fbers of PLLA. Arrows indicate matrix fber direction[18].

3 電紡用于細胞支架制備的新思維

3.1 共混電紡或共聚物電紡

共混紡絲是一種有效改善電紡纖維性能的方法，不同的材料由于生物相容性、降解速度、機械強度、可紡性等方面的差異，一種材料已無法滿足組織支架的要求，因此，各種支架制備材料的共混組合相繼被開發了出來。例如聚乙烯吡咯烷酮 (Polyvinyl pyrrolidone，PVP) 在空氣中極易吸濕，所制纖維不能長時間存放，尤其當所紡纖維為納米級時，更不容易保存，但通過將PVP與聚環氧乙烷 (PEO)、共聚維酮S~630及聚偏二氟乙烯 (PVDF) 進行共混電紡，降低 PVP納米纖維的吸濕性[26]；鮑韡韡等[23]將絲素和明膠以不同質量比共混于甲酸溶劑，電紡制得了在絲素與明膠質量比為 70∶30下的平均直徑為83.9 nm的納米纖維，不僅有利于克服低質量分數絲素紡絲溶液電紡中出現的珠狀物和斷頭多等問題，而且有望應用于生物組織工程中。但是很多情況下兩種材料的相容性差，找不到共溶劑[32]，所以溶液共混電紡只適用于少數幾種高聚物，因此有人提出利用熔體電紡克服這一問題[9]。針對溶液共混電紡所存在的缺點，本研究組發明了一種熔體靜電紡絲生產復合纖維的裝置，該裝置可以同時對兩種或多種聚合物進行熔體紡絲，以制得并列型或皮芯型等類型的復合纖維[35]。

3.2 同軸電紡技術

傳統的復合纖維由于兩種材料很少能同時溶解于同一溶劑，而同軸電紡技術則解決了這一問題，它不但可以滿足不同材料的混合電紡，同時其獨特的芯-殼結構為支架提供了更好的機械性能和生長環境，一方面其芯材料可以隨著殼材料的降解而逐漸釋放，同時也可以用于藥物釋控的應用。這種方法非常適用于天然材料和合成材料的復合紡絲，一般外噴頭中的紡絲液為天然材料，內噴頭中的紡絲液為合成材料，制備出來的纖維為同時具備良好的生物黏附性和較好的物理機械性能的芯-殼結構的納米纖維。

黎雁在其博士論文[36]中提到用此裝置將模型蛋白BSA和溶菌酶分別混入聚乙二醇 (PEG)水溶液中作為內層紡絲液，PCL溶于二甲基甲酰胺和氯仿的混合溶劑作為外層紡絲液，得到了具有芯-殼結構的納米纖維膜，這種包埋方法有效避免藥物的突然釋放引起的細胞失活，使水溶性蛋白質以穩定的速度持續釋放。McCann[37]則報道了用同軸熔體電紡制備微膠囊和相變納米纖維的方法，所用裝置如圖3所示，在塑料注射器末端的金屬針頭內插入聚合物涂敷的硅毛細管，這樣，熔點在室溫左右的含16~20個碳的烷烴就可以與溶劑 (殼層PVP/TiO2：) 一起從同軸噴絲頭中噴出，在紡絲過程中，噴射物的冷卻主要依賴溶劑的蒸發而使里面的熔融態固化。與傳統同軸電紡相似，電紡的材料 (熔融態或固態) 必須不溶于溶劑才能獲得芯-殼結構的纖維。芯-殼型結構的納米纖維可廣泛用于不穩定的生物試劑的保存、防止不穩定的化合物分解、分子藥物的持續釋放、組織工程支架的構建、導電納米線、軍事中的生物化學防護服等方面。

圖3 同軸電紡裝置[37]Fig. 3 Schematic of the melt coaxial electrospinning setup used for fabricating TiO2-PVP nanofibers loaded with hydrocarbon PCMs[37].

3.3 電紡技術和快速成型方法的結合

可能同一組織的不同部分或不同組織層需要不同的支架形態和功能，這就需要電紡提供靈活多變的纖維直徑和取向，一直以來電紡技術中的纖維取向方法都比較單一，主要是通過改變纖維或是通過接收輥子的水平和旋轉運動獲得單向取向的纖維[9,38]，最近本研究組發明了一種結合電紡和快速成型技術的新方法 (圖4)，有望為電紡在組織工程中的應用帶來新突破，其基本思想就是利用納米級纖維的電紡設備，結合快速成型中的精密接收裝置，獲得任意想要的三維立體結構，有望實現對纖維直徑、支架孔隙率和孔徑、纖維形態的動態實時控制[39]。

3.4 一些后處理技術

圖4 一種結合電紡和快速成型的裝置示意圖[39]Fig. 4 Schematic of a electrospinning device based on rapid prototyping process which mainly includes tip electrode, electrode scaffold, DC voltage source, platform and moving system, capillary, nozzle, stand and spinning control system[39].

盡管電紡技術制備的支架在強度、生物相容性、可降解性方面性能卓越，且結構簡單，操作容易。但是對于嚴格的組織培養，仍然需要一定的后處理來完善其性能，以便模擬更加符合細胞外基質的條件。戴有剛等[20]研究了乙醇對絲素(SF) /PLGA人工血管后處理以后的力學性能，發現100%乙醇水溶液處理后明顯提高了其管狀支架材料的強度，但是脆性增加，柔軟性下降。一般為了獲得不能直接電紡的纖維，利用同軸電紡，制備好后可以用適當的溶劑去掉殼層結構，也可以利用適當的溶劑將內核去除，制成納米微管。Wang等[40]首先制備了硅膠包裹潤滑油/PVP的芯-殼納米纖維，然后將核層的潤滑油和PVP除去，得到SiO2納米管，內徑僅有20 μm，并允許單分子從中通過。研究發現，不同的后外理方法對PLLA支架形貌影響差別很大，在制造和使用支架過程中應盡量避免一些對支架結構形貌有影響的處理方式，如對支架進行滅菌，盡量選用對支架影響較小的環氧乙烷滅菌法；又如在支架上進行細胞培養應盡量避免使用乙酸異戊酯進行脫水，直接使用鋨酸固定及真空干燥，以保護支架和細胞，從而得到更好的實驗結果。Zong等[18]在心臟組織支架的制備過程中，進行了雙軸取向拉伸的后處理，獲得了各項異性的PLGA膜支架，隨著拉伸率的提高，纖維的孔隙率降低，所以提出雙向拉伸可以有效地控制電紡支架的取向和孔隙率。

3.5 多層電紡和混合電紡

除了同一根纖維中復合多種材料的共混電紡和同軸電紡，一些研究者還利用了多層纖維結構，以滿足不同組織的要求，即不同的組織區位使用不同的紡絲材料和電紡工藝，甚至同一個支架，不同層的纖維使用不同的纖維制備工藝和電紡工藝結合起來，充分利用不同制備工藝的優點。Kidoaki等[41]提出了多層電紡 (Multilayering electrospinning) 和 混 合 電 紡 (Mixing electrospinning) 的加工方法，在多層電紡中，I型膠原 (Collagen) 苯乙烯化明膠 (ST-Gelatine)和聚氨酯 (PU) 依次沉積到同一收集屏上，層層疊加，最終得到了具有3層結構的纖維膜；在混合電紡中，PU和PEO分別從2個噴口同時沉積到一個高速旋轉并作水平運動的接收輥上，獲得了2種材料交叉編織的復合纖維膜，這些方法有助于提高纖維支架的孔徑和孔隙率，便于細胞的生長和遷移。

混合電紡是載有不同聚合物溶液的2個或多個噴絲頭同時紡絲。這兩種方法都可以根據具體的要求得到針對性較強的細胞支架，在組織工程支架的制備方面有很好的發展前景。

葛麗芹等[42]通過將層層組裝技術轉移到一維電紡納米纖維表面后選擇性的去除模板獲得一類全新的材料-中空多層有機復合納米纖維(圖 5)。他們發現在堿性條件下有機聚合物在模板上的生長速度是最快的，而且表面的形貌也保持得相當好，可以看成是pH的最優條件，沉積10層有機聚合物在模板上的結果比較令人滿意，而且表面的形貌也保持的比較好，可以看成是沉積層數的最優條件。

圖5 基于電紡技術的中空多層聚合電解質納米纖維[42]Fig. 5 Hollow multilayered polyelectrolyte nanofiber based on electrospinning method [42].

4 電紡在組織工程應用的研究展望

溶液電紡工藝的不斷完善和發展為其在組織工程中的應用打下了良好的基礎，其溫和的加工工藝也使得在人體組織或細胞培養基上直接電紡成為可能。同時具有特殊功能和精確控制的電紡裝置不斷出現為更為復雜的組織支架的制備創造了條件。熔體電紡工藝的不斷進步也為環境友好的組織支架制備帶來了新的希望。但是目前也存在不少問題和改進之處：

1) 電紡工藝穩定性、重復性差，實現紡絲過程的精確實時控制，并逐步開展量產的研究有利于電紡制備生物支架工藝的進一步完善。

2) 針對溶液紡絲中殘留溶劑的問題，應當利用更加經濟或安全的溶劑替代有環境危害性或是殘留致病性的溶劑，同時深入研究熔體電紡在組織支架纖維制備中的應用有更加重要的意義。

3) 組織工程細胞支架具有其自身的特點，更加重視仿生設計在電紡中的應用，將其和電紡、快速成型技術結合起來，迅速推動支架優化、取向優化的組織支架的研究和應用，這也是電紡技術的發展方向之一。

4) 在以往的研究中過多地考慮了工藝，忽視了紡絲材料，通過電紡材料的改性、優化后處理工藝、改進材料生物相容性及其力學性能等來改進細胞支架細胞培養過程中活性傳輸特性，可以保證細胞健康快速的增殖。

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Electrospinning technology in tissue engineering scaffolds

Haoyi Li, Yong Liu, Xuetao He, Yumei Ding, Hua Yan, Pengcheng Xie, and Weimin Yang
College of Mechanical and Electrical Engineering, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

Tissue engineering technology provides a new method to repair ill tissue and worn-out organs. In tissue engineering, scaffolds play an important role in supporting cell growth, inducing tissue regeneration, controlling tissue structure and releasing active factor. In the last decade, electrospinning technology developed rapidly and opened vast application fields for scaffolds. In this review, we summarized the technological conditions of electrospinning for scaffolds, the study of electrospun fiber scaffolds applied in tissue cell cultivation, and some new directions of electrospinning technology for scaffolds. We also addressed development directions of electrospinning research for scaffolds.

tissue engineering, electrospinning, cell scaffold

組織工程學 (Tissue engineering)，由美國國家科學基金會于1987年提出，其目的是培養生物替代品來補救或替換損傷和老化的器官和組織。一種前景比較好的方法就是在可降解支架上移植細胞進行培養，但如何設計支架使其能夠引導組織的再生是組織工程的一個難點[1]。

May 22, 2011; Accepted: August 5, 2011

Weimin Yang. Tel: +86-10-64434322; Fax: +86-10-64434734; E-mail: yangwm@mail.buct.edu.cn

李好義, 劉勇, 何雪濤, 等. 應用于組織工程支架制備的電紡技術. 生物工程學報, 2012, 28(1): 15–25.

Li HY, Liu Y, He XT, et al. Electrospinning technology in tissue engineering scaffolds. Chin J Biotech, 2012, 28(1): 15–25.