三色堇花粉生活力的測定

周玉敏，徐自警

（湖北生態職業技術學院，武漢 430200）

三色堇（ViolatricolorL.），堇菜科堇菜屬多年生草本植物，在其雜交制種和不育系繁殖過程中，父本花粉的產量及其質量是確定群體種植比例的主要依據之一［1］。筆者采用I－KI染色法、醋酸洋紅染色法TTC染色法、過氧化物酶沉淀法、培養基離體萌發試驗法對三色堇進行花粉生活力的測定，以期篩選出最佳測定方法，為三色堇大規模制種和貯藏花粉的生活力鑒定提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料的采集和處理

實驗用花粉采集于學院苗圃地栽培的三色堇，于2011年2月6日上午8：00采摘已開花尚未散粉的三色堇花供測定用。選了5種花色的品種即：一花三色的品種1、純黃的品種2、黃紫相間的品種3、花瓣邊緣呈波浪狀的品種4、重瓣形的品種5。將采集來的材料放入4℃冰箱中預處理2h，取出花藥，放入準備好的墊有濾紙的培養皿上，放進恒溫干燥箱，溫度保持在22～25℃中，讓其干燥散粉，以待備用［2］。

1.2 試驗方法

1.2.1 I－KI染色法。取準備好的花藥，置于載玻片上，滴1小滴I－KI（0.1%）溶液，輕輕擠壓花藥，涂于載玻片上，蓋上蓋玻片，迅速在顯微鏡下觀察，有活力的花粉被染成藍色。

1.2.2 TTC染色法。取準備好的花藥適量放在一個小玻璃皿內，加入適量TTC溶液，輕輕擠壓花藥，使花粉粒散在TTC溶液中，放在25℃恒溫箱中15min，然后在顯微鏡下觀察。有活力的花粉被染成紅色。

1.2.3 醋酸洋紅染色法。取準備好的花藥，置于載玻片上，滴1滴醋酸洋紅溶液，輕輕擠壓花藥，置于載玻片上，蓋上蓋玻片，片刻后在顯微鏡下觀察。有活力的花粉被染色紅色。

1.2.4 過氧化物酶沉淀法

首先將以下試劑配好：①0.5%聯苯胺；②0.5%a－蔡酚；③0.25%碳酸鈉；④0.3%過氧化氫。試驗前再將溶液①、②、③各10m L混合成試劑I，溶液④為試劑II，在干潔載玻片上放少量準備的花粉，然后加試劑I、II各1小滴，攪勻后蓋上蓋玻片。30℃條件下10min后在低倍顯微鏡下觀察。有活力的花粉被染成紅色。

1.2.5 培養基萌發試驗法

①培養基溶液的配制。將0.8g瓊脂放入盛有少量蒸餾水的100m L小燒杯中加熱、攪拌至充分溶解后分成多份，再在其中加入蔗糖和硼酸，分別配成A、B兩組培養基溶液：A組為蔗糖濃度不變（質量濃度為30mg／L）而硼酸濃度變化（質量濃度分別為0、1.0、1.5、2.0、2.5mg／L）的5種培養基濃度；B組為硼酸濃度不變（質量濃度為2.0mg／L）而蔗糖濃度變化（質量濃度分別為0、10、15、20、25、30mg／L）的6種培養基溶液。

②花粉接種。在超凈工作臺將配制好的培養基均勻地倒入凹玻片中，使與玻片齊平，待凝固后，用消毒過的頭發絲將已準備好的花粉接種到所設定的培養基凹玻片上。標注花粉種類、培養基配方號、采集時間和接種時間，放于20～25℃的恒溫箱內。

③鏡檢和花粉萌發率統計。接種花粉2h后開始觀察花粉萌發情況，了解花粉的萌發速度和花粉管的生長情況。以花粉管長度超過1／2花粉直徑的為有活力的萌發花粉［3］。

花粉萌發率的計算公式：花粉萌發率（%）＝（萌發花粉粒／總花粉粒數）×100%

1.2.6 綜合比較試驗。將準備好的花粉分別按照5種方法測定花粉生活力，每處理3個重復，每重復觀察10個視野，取平均值計算［4］。

2 結果與分析

2.1 三色堇花粉的染色率和萌發率

2.1.1 幾種染色方法對三色堇花粉粒的染色結果。通過顯微觀察，三色堇花粉粒近長柱形，具5孔溝，兩極有近圓形的平面，中部粗糙，外壁光滑。實驗結果表明，與培養基萌發試驗法相比，I－KI染色法、醋酸洋紅染色法、TTC法的效果較差，均不適合三色堇花粉生活力的測定，而過氧化物酶沉淀法的測定結果與培養基萌發法的測定結果十分相近。過氧化物酶沉淀法更為準確，是三色堇花粉生活力測定中最理想的測定方法。

2.1.2 不同濃度的蔗糖對三色堇花粉萌發的影響。蔗糖濃度是影響花粉萌發率的重要因素之一，三色堇品種1的備用花粉在B組培養基上培養24h后，對應于蔗糖質量濃度為0、10、15、20、25、30mg／L的培養基上的萌發率分別為0、8.67%、15.88%、35.04%、19.21%、13.12%。萌發率隨著蔗糖質量濃度的變化而變化，當蔗糖質量濃度為20mg／L時，萌發率達到最大值35.04%。

2.1.3 不同濃度的硼酸對三色堇花粉萌發的影響。硼酸濃度對三色堇花粉萌發也有一定的促進作用。三色堇品種1的備用花粉在A組培養基上培養24h后，對應于硼酸質量濃度為0、1.0、1.5、2.0、2.5mg／L的培養基上的萌發率分別為0、15.11%、38.24%、20.10%、11.48%。隨著硼酸質量濃度的增加，花粉的萌發率呈現先上升后降的趨勢。當硼酸質量濃度為1.5mg／L時，萌發率達最大值38.24%。

2.1.4 五個花色三色堇花粉萌發率的比較。五個花色三色堇備用花粉粒在含質量濃度分別為20mg／L、1.5mg／L的蔗糖和硼酸的瓊脂培養基上的萌發情況見表1。從表中看出，5個花色三色堇中，一花三色的品種1的花粉生活力最強，其次是花色為純黃的品種2，重瓣形的品種5花粉的生活力最差。

表1 三色堇花粉的萌發情況

2.2 低溫儲藏后三色堇花粉的染色率和萌發率

三色堇花粉在溫度為2～5℃，空氣濕度為30%～50%的條件下貯藏2～5天后，再次對其進行染色試驗和萌發試驗。試驗結果顯示：其染色率與備用花粉沒有大的變化，但在含質量濃度分別為20mg／L、1.5mg／L的蔗糖和硼酸的瓊脂培養基上的萌發率有明顯變化。培養14h后，5個花色三色堇的花粉都有明顯的萌發；培養24h后，品種1、品種2、品種3、品種4、品種5五個花色三色堇花粉的萌發率分別為90.5%、84.1%、80，2%、78.5%、80.2%。但是隨著貯藏時間的繼續延長而花活生活力下降。

3 小結

3.1 在實驗所進行的5種試驗方法中，I－KI染色法、醋酸洋紅染色法和TTC染色法效果不明顯，不適用于三色堇花粉生活力的測定，這主要是由于三色堇的花粉壁較厚，染色物質不容易進入造成的。過氧化物酶沉淀法和培養基萌發試驗法，表現出對三色堇花粉快速、準確地染色效果，故可認為其是測定三色堇花粉生活力的最佳染色方法。

3.2 蔗糖起著維持花粉與培養基之間滲透平衡的作用，也是花粉萌發的營養物質和能量來源。蔗糖濃度對花粉萌發有明顯影響。不同植物花粉萌發的適宜蔗糖濃度有所不同。本次試驗發現蔗糖質量濃度為20mg／L時能較好地促進三色堇花粉萌發；硼酸可以促進糖的吸收與代謝，增加氧的吸收，參與果膠的合成，有利于花粉管在生長壁中的建造。本次試驗發現硼酸質量濃度為1.5mg／L時對三色堇花粉萌發有較好的促進作用。

3.3 花粉貯藏時，隨著貯藏時間的增加，花粉內貯藏物質的消耗增多，酶活性下降，水分逐步流失，花粉的生活力會逐漸下降。因此，花粉的貯藏環境與花粉生活力密切相關，即保存的花粉比新鮮花有更高的離體萌發率。這個發現對于花粉的貯藏具有很大的意義。

［1］ 王孝鵬，孫曉梅.三色堇花粉生活力最佳測定方法的篩選［J］.安微農業科學，2008，36（7）：2756－2769.

［2］ 賈文慶，劉宇.紫薇花粉生活力的測定［J］.陜西農業科學，2007（1）：46－48.

［3］ 張志良.植物生理學實驗指導［M］.北京：高等教育出版社，2000：240－242.

［4］ 張亞利，曾憲寶.梅花花粉生活力的測定和比較［J］.湖北農業科學，2005（6）：84－86.