熊膽精制液儲存中的質量穩定性研究

韓秋偉，張曉旭

（1.黑龍江林業職業技術學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.中山大學藥學院）

熊，食肉目，是屬于熊科的雜食性大型哺乳類，以肉食為主，別名黑瞎子。種類較少，全世界僅有7種，我國有3種：馬來熊、棕熊、黑熊。熊，全身都是寶，其中以熊膽最有價值。黑熊為國家二級保護動物，為保護野生熊資源，近幾年養熊采膽技術得到了很快的發展。

熊膽粉是熊科動物黑熊經膽囊手術引流膽汁的干燥品。

熊膽作為中國四大動物藥材之首，入藥已有幾千年歷史，素有“藥中黃金”之美譽。《本草綱目》載：熊膽味苦、性寒，歸肝膽心經，無毒，能清熱、平肝、利膽、明目、殺蟲。現代藥理學研究證實：熊膽具有清熱解毒、抑菌抗炎、保肝護肝、利膽溶石、降脂降壓、鎮咳平喘、去翳明目、抗疲勞等多方面的藥理功能，尤其是治療膽囊炎、膽結石更是功效獨特。

熊膽主含牛黃熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、膽酸，多與牛黃酸或甘氨酸等形式結合膽汁酸而存在，另含膽固醇、膽紅素及無機鹽等。根據熊膽具有的藥理作用，目前熊膽制劑發展的迅速。從簡單的直接應用熊膽粉入藥，發展到利用精制熊膽粉入藥的階段。精制熊膽粉是除去熊膽粉中蛋白質和粘液質、膽汁酸等雜質，對制備液體制劑，保證顏色、氣味、澄明度、避免不良反應發生等質量問題得到了保證。為了適應大生產，需要批量生產精制液。本文重點研究精制液的冷凍儲存的質量穩定性。

1 儀器與試藥

美國先德公司生產的PC－2000高效液相色譜儀、SSI－3000紫外檢測器、ST－400柱溫箱、10μL微量進樣器、減壓干燥器、SB－3200型超聲波清洗器、ADS－135型十萬分之一分析天平、JYP－2架盤天平。

牛磺熊去氧膽酸對照品（有中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號110816－200906）、沈陽華東生產的色譜級甲醇、磷酸二氫鈉、0.45μm有機濾膜、水為重蒸餾水。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇－磷酸二氫鈉溶液（0.03mol／L）（68∶32）為流動相，并用磷酸調p H值為4.4，檢測波長為210nm，柱溫為40℃，流速為1.0m L／min。理論板數按牛磺熊去氧膽酸峰計算，應不低于2500。

2.2 對照品溶液與供試品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備。取經五氧化二磷容器中減壓干燥至恒重的牛磺熊去氧膽酸對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解并定量稀釋制成每1m L含1mg的溶液，即得（相當于牛磺熊去氧膽酸0.9578mg）。

2.2.2 供試品溶液的制備。取引流熊膽粉精制品適量（相當于熊膽粉0.12g），精密稱定，置50m L量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率300W，頻率50k Hz）10min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，收集續濾液，即得。

2.2.3 測定方法。精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5～10μL，分別注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 穩定性試驗

取供試樣品溶液，定時（0、3、6、9、12、18、24h）進樣測定，保留峰面積積分值分別為：529771、544174、549652、539884、529554、543211，平均值為543707，RSD＝1.51%。測定結果表明，樣品溶液在24h內基本穩定。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10μL，重復進樣6次，保留峰面積積分值分別為：334463、333690、323125、330456、337473、331841，平均值為331841，RSD＝1.65%。符合國家標準要求。

2.5 線性關系的考察

精密吸取牛磺熊去氧膽酸對照品溶液（1.0mg／m L）0.5，1.2，5.5，10，20μL，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標，以牛磺熊去氧膽酸對照品進樣量（μL）為縱坐標，繪制保準曲線，回歸方程為：Y＝498.7X－ 0.0752，r＝0.9974。結果表明牛磺熊去氧膽酸進樣量約在4.2～12.5μL呈良好的線性關系，最小檢出限（信噪比≥3）為0.56μL。

2.6 重現性試驗

取同一批次的引流熊膽粉精制品，依照上述處理方法，按前述測定方法重復測定樣品6次，牛磺熊去氧膽酸含量為11.21%、11.01%、11.07%、10.89%、10.76%、10.94%，平均為10.98mg／m L，RSD＝1.41%，結果表明此法重現性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密吸取已知含量的同一批引流熊膽粉精制品20m L，精密加入牛磺熊去氧膽酸對照品溶液適量，按照樣品溶液處理的制備方法操作，測定其含量，并計算回收率為97.56%、97.01%、98.11%、97.22%、96.98%、98.46%，平均為97.56%，RSD＝0.63%。

2.8 樣品測定結果

分別精密吸取對照品溶液與樣品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，依上述色譜條件，以外標法計算含量，測定樣品。

2.8.1 常溫下引流熊膽粉精制品含量測定

表1 常溫下引流熊膽粉精制品含量 mg·m L－1

2.8.2 不同溫度條件儲存下的引流熊膽粉精制品，儲存時間30天后，在常溫條件下進行含量測定及無菌檢查。

表2 不同溫度下儲存對含量的影響

續表1

3 討論

3.1 引流熊膽粉精制品儲存過程中溫度對含量的影響。在20℃、0℃、－5℃、－10℃、－15℃、－20℃、－22℃、－24℃、－26℃、－28℃、－30℃等不同儲存溫度條件下，對引流熊膽粉精制品儲存30天后，在常溫條件下進行含量測定，確定引流熊膽粉精制品儲存溫度。3.2 引流熊膽粉精制品儲存過程中溫度對無菌的影響。在20℃、0℃、－5℃、－10℃、－15℃、－20℃、－22℃、－24℃、－26℃、－28℃、－30℃等不同儲存溫度條件下，對引流熊膽粉精制品儲存30天后，依據中華人民共和國藥典10版，附錄ⅩⅢB無菌檢查法進行檢查，在常溫條件，進行無菌檢測，在硫乙醇酸鹽流體培養基（Thioglycollate Medium）、改良馬丁培養基（Modified Martin Medium）應無細菌和真菌檢出，為適宜的儲存溫度。

3.3 熊膽粉為不規則的碎片、顆粒或粉末，黃色至深棕色，半透明，有玻璃樣光澤，易吸潮結塊有粘牙感，腥臭，味極苦。精制液位淺黃色液體，精制后不含蛋白質及粘液質等雜質，無腥臭味。對改變制劑的顏色、氣味、澄明度、避免不良反應發生有重要意義。

3.4 經以上實驗結果，利用高效液相色譜法確定引流熊膽粉精制品測定的色譜條件和適用性試驗。利用高效液相色譜法測定引流熊膽粉精制品的含量具有專屬性強及結果準確等特點。經過實驗數據的統計，確定引流熊膽粉精制品長期存儲的儲存條件，確保應用引流熊膽粉精制品的制劑的穩定性，為保證制劑質量提供依據。

［1］ 石麗霞.熊膽注射劑的研制與臨床應用［J］.中草藥，1998，21（11）：592.

［2］ 徐愚聰.熊膽粉的研究進展［J］.華西藥學雜志，2000（3）.

［3］ 金正男.熊膽注射液的降血脂作用［J］.中草藥，1997（4）.

［4］ 劉玉根.痰熱清注射液的臨床應用及不良反應［J］.中國民族民間醫藥，2010（9）.