水楊酸鈉耳蝸毒性與Src的關系*

鄧莉俐 王仁君 綜述 蘇紀平 審校

1 廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧 530021)

水楊酸鹽是臨床上常用的解熱、鎮痛、抗炎、抗風濕藥物，但其對聽覺系統的副作用如可導致耳鳴、可逆性的30～40 dB的聽力下降等仍是臨床上亟待解決的問題。研究已發現，水楊酸鈉的耳毒性機制與谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸(N-metlyl-d-aspartate,NMDA)介導的興奮毒性有關，并且能通過內源性Src激酶家族調節。本文就水楊酸鈉的耳蝸興奮毒性及其與Src的關系進行綜述。

1 水楊酸鈉的興奮毒性

谷氨酸是哺乳動物中樞神經系統一種主要的興奮性神經遞質，但由于各種生理或病理原因造成谷氨酸濃度過高，過度刺激其突觸后受體，則會產生細胞毒性，即興奮毒性。過高濃度的谷氨酸激活PA/KA受體，促進大量Na+、Cl-和水內流進入細胞，致細胞腫脹[1]；同時，過量的谷氨酸過度激活NMDA受體，致Ca2+通道病理性開放，引起大量Ca2+內流，細胞內Ca2+超載，線粒體功能失活，自由基產生以及ATP能量衰竭，Caspase酶級聯反應激活，細胞凋亡[2]。臨床上，這種興奮毒性所造成的細胞損傷很常見，如急性的局部缺血、腦外傷時,興奮毒性直接介導神經細胞的丟失；在慢性神經退行性疾病(如老年性癡呆、肌萎縮型側索硬化、帕金森病、亨廷頓病等)中,興奮毒性也介導了神經機能異常。

水楊酸鈉是阿司匹林的主要代謝產物和有效成分，廣泛應用于解熱、鎮痛、抗炎、抗風濕和抗血栓形成等多方面臨床治療。但在神經系統，水楊酸鈉對不同狀態下的神經元作用迥異，既有神經保護作用，亦有神經毒性作用。

實驗證明，在許多情況下，水楊酸類藥物對神經細胞有良好的神經保護作用。Wang等[3]報道，在酸中毒的大腦皮層神經元模型中，用膜片鉗全細胞記錄模式，可以檢測到300 μM到30 mM的水楊酸鈉或阿司匹林通過作用于酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)，能可逆性抑制ASIC電流，顯著減少酸中毒引起的皮層神經元死亡數量，從而使大腦皮層細胞免受損傷。在原代培養的中腦組織中，用免疫組化染色的方法也可以觀察到0.01～1 mM阿司匹林能明顯抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LP)誘導的神經毒性，通過檢測觀察到阿司匹林主要抑制了LP誘導的氧化應激和/或炎癥反應，減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，同時促進抗炎細胞因子白介素-10(interleukin,IL-10) 和轉化生長因子 1(transforming growth factorbeta-1,TGF- β 1)的釋放，從而保護多巴胺能神經元免受LP引起的神經毒性損害[4]。此外，在NMDA造成視網膜神經節細胞興奮毒性的模型中，阿司匹林還能通過直接抑制蛋白激酶Cζ(protein kinase C zeta,PKCζ)自身裂解或在細胞核中易位而阻止其被活化，減少誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及一氧化氮(nitric oxide,NO)的表達,使視網膜細胞免受損傷, 發揮神經保護作用[5]。另一方面， Katz 等[6]卻報道給大鼠腹腔注射1 700 mg/kg水楊酸鈉40分鐘內可致死大鼠，而抑制水楊酸鈉導致的線粒體膜通透性轉換(membrane permeability transition，MPT)，能明顯延長注射致死劑量水楊酸鈉的大鼠的生存時間。在PC12細胞株和大鼠耳蝸器官的培養中,水楊酸鈉也誘導了神經細胞凋亡并呈現濃度依賴性[7，8]。為探討水楊酸鈉對中樞神經系統毒副作用的機理，Gong等[9]應用膜片鉗技術，觀察水楊酸鈉對海馬CA1區興奮性突觸后電位(eld excitatory postsynaptic potentials,field EPSPs，fEPSPs)和細胞群體峰電位(population spike ，PS)的影響時發現，水楊酸鈉明顯增強PS的峰值，卻對fEPSPs沒有明顯的影響，進一步觀察發現水楊酸鈉通過抑制γ-氨基丁酸(γ-aminobutvric acid,GABA)能神經傳遞增強了神經興奮性，但對基本的興奮性神經突觸傳遞并無影響。

以上實驗結果提示，水楊酸鈉作用機制的復雜性和多樣性導致了水楊酸鈉的不同作用表現。實驗模型、藥物劑量、處理時間以及體溫、營養等多方面因素都能影響水楊酸鈉作用結果的變化。水楊酸鈉對神經細胞的保護作用是主要針對缺血、缺氧、酸中毒等病理條件而言的，主要通過抗氧化、抗炎機理，抑制NF-κB的活化等機制來實現。而水楊酸鈉的細胞毒性作用機制則是其自身毒性對正常細胞的損傷而言，其機制與其經典的藥物作用機制不同，既可以直接誘導MPT，產生氧化磷酸化脫偶聯，直接促使細胞凋亡，也可通過阻斷抑制性受體功能，造成興奮性受體過度興奮，產生興奮毒性。

2 水楊酸鈉與耳蝸螺旋神經節神經元的凋亡

谷氨酸是耳蝸內毛細胞與耳蝸螺旋神經節神經元(spiral ganglion neurons，SGN)突觸的重要神經遞質。谷氨酸受體廣泛分布于哺乳動物的聽覺系統，如N-甲基-D天冬氨酸受體(N-methyl-d-aspartate receptor,NMDAR)、α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體(al-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor,AMPAR)、海人藻酸受體(kainate，KAR)在耳蝸中均有表達。

損傷性噪聲、耳蝸缺血、外傷等都可引起谷氨酸從內毛細胞過度釋放，導致SGN興奮性毒性,表現為SGN神經元的腫脹(空泡化)以及內毛細胞附近樹突末梢的空泡形成，最后神經細胞凋亡[10，11]。直接將體外培養的SGN暴露于高濃度的谷氨酸鹽中，亦能誘導SGN凋亡，并呈濃度依賴性，而應用caspase-3阻斷劑能對抗谷氨酸鹽引起的SGN凋亡[12]。

Guitton等[13]在水楊酸鈉誘導的耳鳴大鼠模型中，通過圓窗在耳蝸外淋巴液中給予NMDA受體阻斷劑5-甲基二氫丙環庚烯亞胺馬來酸(dizocilpine maleate,MK-801)、7-氯犬尿酸(7-chlorokynurenic acid,7-CK)、加環利定(gacyclidine)后，觀察到大鼠的耳鳴明顯減弱，證明水楊酸鈉引起的耳鳴與耳蝸的NMDA受體有關，是水楊酸鈉興奮毒性的表現。迄今為止，已有許多關于水楊酸類藥物對聽覺系統的毒副作用的研究，大多認為水楊酸鈉的作用機制是個復雜的過程，大劑量的水楊酸類藥物損傷神經功能可以沿著聽覺通路，從毛細胞和初級聽覺神經元(SGN)到大腦中樞聽覺皮層的任一環節起作用[14～17]。毛細胞和SGN作為這個反應的外周環節，起著重要作用。但較毛細胞而言，SGN對水楊酸鹽的毒性更敏感。體內外實驗都已證明，1 mM的水楊酸鹽即可引起顯著的SGN毒性[18]，而毛細胞則需要5～7 mM甚至更高的濃度[19],最近甚至有報道高濃度的水楊酸鈉損傷SGN，卻能增強毛細胞的功能[20]。盡管文獻報道水楊酸鹽對多種神經細胞有保護作用[2～4]，但用水楊酸鈉直接作用于體內或體外培養的SGN組織時，卻觀察到水楊酸藥物促進了SGN的凋亡，并呈現出時間和劑量的依賴趨勢[8, 18, 21，22]。其具體機制目前并沒有完全明了。Jung等[8]用水楊酸鈉作用于SGN后，檢測到其細胞活性明顯降低,利用熒光染色標記出其凋亡率明顯增高，SGN細胞上多種熱休克蛋白以及Bcl-2的表達發生了改變，為水楊酸鈉的神經毒性作用提供了一部分病理依據。Wei等[18]亦觀察到水楊酸鈉作用后SGN呈現胞體萎縮、軸突縮短甚至消失的典型凋亡形態學改變，SGN上多種與凋亡相關的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)也發生了改變，推測水楊酸鈉所引起的SGN凋亡與caspase介導的凋亡通路有關。Feng[21，22]則用免疫組化方法驗證了水楊酸鈉誘導的SGN凋亡與caspase-3有關，水楊酸鈉對SGN的興奮毒性作用是通過caspase依賴性的凋亡通路實現的。

3 Src家族與水楊酸鹽的興奮毒性

3.1 Src家族的結構及功能 Src家族是一組膜結合的非受體型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK),現已知Src家族包括Src、Lck、Fyn、Yes、Lyn、Hck、Fgr、Blk、Frk亞科9個成員，它們的表達有組織特異性，其中Src、Lck、Fyn、Yes、Lyn在中樞系統中均有高表達。Src家族成員的結構特征是N端的豆蔻酰化、一個不同源的獨特結構域、兩個調節結構域(SH2和SH3)、一個保守的催化結構域(又稱激酶結構域，kinase domain,KD)和C端負調控區域。Src家族通過信號轉導作用，參與調節細胞生長、分化、繼續生存以及神經細胞的突觸傳遞等功能，并且能影響細胞粘附、遷移和入侵的能力[23]。

3.2 Src家族對興奮毒性的調節作用 興奮毒性在細胞缺氧、外傷等病理過程中發揮著重要作用，其主要機制由NMDA受體介導。在中樞神經系統中，Src家族的一個重要作用是調節各種離子通道的活動，如電壓門控性鉀離子通道[24]、鈣離子通道[25]、煙堿乙酰膽堿受體[26]等。 Src對NMDA受體也有明顯的調控作用，主要有以下幾個方面：①介導興奮毒性：XU等在大鼠大腦外傷后的病理過程中觀察到，Src通過對突觸后密度-95(postsynaptic density-95,PSD-95)酪氨酸磷酸化介導了興奮毒性損傷機制的啟動和增強[27]。Xu等[27]也在缺血再灌注的大鼠模型中通過激活GluR5受體使Src酪氨酸磷酸化功能下降，并影響其與PSD-95、NR2A的相互作用，進而使NMDA受體的活性下降，興奮毒性減弱；②調節突觸和突觸可塑性：在小腦顆粒細胞突觸形成過程中，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受體F1K1與NMDA受體亞基NR1和NR2B組成復合體。VEGF與F1K1結合時，通過激活Src激酶家族而使復合體中NR2B磷酸化增強，NMDA 受體電流和Ca2+內流(Ca2+influx)增大，這種增大的Ca2+內流能促進小腦顆粒細胞遷移，對神經細胞的突觸形成起重要作用[28]；③易化痛覺感受：在用鞘內注射NMDA構建的痛覺過敏的大鼠模型上，鞘內注射Src激酶抑制劑PP2能阻止NR2B受體亞基的酪氨磷酸化，減弱NMDA誘導的NR2B受體突觸表達，使大鼠的機械觸感的敏感性下降，痛覺敏感性降低[29]；④介導藥物成癮：在可卡因成癮的小鼠模型中，Src激酶誘導的NMDA受體亞單位NR2B酪氨酸磷酸化，促進了細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK) 激活，導致了可卡因成癮的發生[30]。

Src激酶家族調控NMDA受體的主要證據有：①Src家族通過SH2和SH3區域與NMDA受體結合，應用聯合免疫沉淀法可標志出Src是NMDA受體蛋白的組成部分，并集中在突觸后密度處(postsynaptic density，PSD)[26]；②Src家族激活后，能促使NR2A、NR2B磷酸化，增強NMDA 受體功能。用抗磷酸化抗體標記NR2A和NR2B受體發現，活體大鼠海馬細胞中約有2.1%NR2A受體亞基和3.6%NR2B受體亞基是被酪氨酸磷酸化的。在NR2A受體亞基中，已發現多個c-Src的磷酸化作用位點：Tyr-1292、Tyr-1325和Tyr-1387。 Src通過這些作用位點使受體亞基酪氨酸磷酸化，阻止Zn2+依賴性抑制作用對NMDA受體的抑制作用，增加NMDA受體的活性而上調NMDA受體功能[31]；③應用細胞電生理技術，在細胞中添加Src或能激活Src家族成員的相關肽，能增強NMDA受體單通道活動，提高NMDA誘導的電流和NMDA受體參與組成的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)；這種增強了的NMDA受體活動能被特異性Src阻斷劑阻斷[32]。

研究表明，NMDA受體電流調控由酪氨酸磷酸化和去磷酸化來保持平衡：抑制內源性Src活動或添加外源性的蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)能抑制NMDA受體功能[33]；反之，應用PTP抑制劑抑制內源性的PTP活動或添加外源性Src，能增強NMDA受體功能[34]。

根據以上實驗結果，推測Src家族對興奮毒性的調節機制可能有:①Src 家族是NMDA受體蛋白的組成部分;②Src 調控NMDA受體的磷酸化。

3.3 Src家族與水楊酸鈉 在非神經細胞中觀察到了水楊酸鈉能抑制Src活性[35，36]。Wang等[35]用免疫沉淀和免疫印跡法在體外培養的心肌中觀察到水楊酸鈉能抑制血管緊張素或血小板衍生生長因子激活c-Src。應用細胞內Ca2+螯合劑或蛋白激酶C抑制劑能減弱水楊酸鈉對Src磷酸化的抑制作用，表明水楊酸鈉對Src活性的抑制作用機制是Ca2+和蛋白激酶C依賴性的。同時，實驗還發現水楊酸鈉對Src活性的抑制作用在濃度為5～20 mM時最明顯，并呈現出濃度依賴性，即水楊酸鈉濃度越高其對Src磷酸化的抑制作用越強。而 Perez等[36]發現在單核細胞中，水楊酸鈉只有在20 mM的濃度時才對Src磷酸化起一定的作用，而低于這個濃度是沒有作用的。但在神經細胞的研究中，仍未見水楊酸鈉與Src的關系的報道。

4 結語

磷酸化對NMDA受體的調控是一系列影響因子作用的結果，在興奮毒性過程中起關鍵作用，通過調節NMDA受體磷酸化，尤其是通過調節Src功能而減少興奮毒性的危害將是神經科學領域研究的一個新的切入點。目前，Src對于水楊酸鈉耳毒性是否具有調節作用仍未見報道，如何通過調節其自身受體磷酸化狀態來影響興奮毒性過程而達到保護神經細胞是目前亟需進一步研究的課題,以期為防治許多內耳疾病提供新的理論依據。

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