莖環法RT-qPCR定量檢測細胞抗豬瘟病毒siRNA的表達

劉帥，李江南，袁婷，楊凡力，逄大欣，涂長春

1 吉林大學畜牧獸醫學院，吉林 長春 130062

2 軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林 長春 130122

RNAi作為一種有效的抗病毒工具，已成功應用于抑制人體免疫缺損病毒Ⅰ型 (HIV-1)[1]、SARS冠狀病毒 (SARS-CoV)[2]等多種病毒的復制增殖。豬瘟 (Classical swine fever，CSF) 是由豬瘟病毒 (Classical swine fever virus，CSFV) 引起的一種高度接觸性傳染病，給養豬業帶來重大經濟損失。CSFV是有囊膜的正鏈RNA病毒，基因組RNA兼具復制和轉錄功能，且非結構蛋白基因保守性比較高[3]，提供了理想的RNAi靶位點。為應用RNAi技術構建抗豬瘟病毒轉基因豬，本研究小組曾針對 CSFV非結構蛋白基因Npro成功設計了2個siRNA——siN1和siN2[4]，并構建了相應的siRNA表達載體——pLox-siN1和pLox-siN2[5-6]，在細胞水平通過檢測病毒的復制和增殖水平，證明了siN1和siN2對CSFV有顯著的抑制效果，但是，抗性細胞中siRNA的表達檢測卻制約了RNAi效果的評價。所以亟需建立一種準確而簡便的siRNA定量檢測方法，對抗豬瘟病毒轉基因豬 siRNA的表達水平及組織表達差異進行有效監測及評價。

目前，已有多種siRNA、miRNA (microRNA)等小RNA的檢測方法。Northern blotting[7]仍是小RNA檢測的金標準，但其特異性和靈敏度不高。而基于LNA (Locked nucleic acid) 標記探針的新型 Northern blotting[8]雖然顯著改善了檢測靈敏度和特異性，但仍存在操作步驟繁瑣、需樣品量大、可檢測范圍低等缺點，更難于準確定量。然而，多種實時定量PCR方法[9-16]被開發出來定量miRNA的表達水平，常用的包括Poly (A) 加尾法[15]和莖環引物法[16]。前者可同時逆轉錄細胞內所有的 miRNA，成本低但靈敏度和特異性均不如后者，適合于miRNA的大量篩選工作。后者創新地設計了具有穩定空間結構的莖環引物，比常規線性引物有更高的特異性和靈敏度，并聯合特異性MGB探針，使其可精確區分同家族高度同源的miRNA，重要的是僅對成熟miRNA進行檢測，而不受其前體 (Pre-miRNA) 干擾。但每種miRNA都需要設計一個對應的莖環引物和MGB探針，成本高且操作相對繁瑣，所以適于少數靶基因的定量檢測。2009年，Cheng等[17]將莖環法 RT-qPCR成功地應用于人工合成siRNA的檢測，并在分子、細胞和動物個體等水平準確定量了未修飾的單鏈siRNA，3末端有兩個突出的雙鏈Silencer?siRNA及LNA修飾的雙鏈Silencer?Select siRNA等3種形式的siRNA，有效地解決了對siRNA傳遞效率、分布和穩定性等難于評價的問題。

在本研究中，我們建立了檢測siN1和siN2兩個抗CSFV的特異siRNA表達水平的莖環法RT-qPCR，準確定量檢測了抗CSFV的PK-15細胞克隆的siRNA表達水平，特異性強，靈敏度高，可精確至100個拷貝，檢測范圍寬。可用于RNAi抗病毒效果的定量評價，為未來轉基因動物的抗病毒效果評價提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和細胞

高效且特異抑制CSFV復制增殖的siRNA表達載體pLox-siN1和pLox-siN2及表達亂序siN1的對照載體pLox-siC均為本實驗室構建并保存[6]；PK-15豬腎傳代細胞系 (85代) 由本室保存；豬胚胎成纖維細胞 (Porcine fetal fibroblasts，PFF) 由吉林大學歐陽紅生教授惠贈。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性內切酶Apal Ⅰ購自NEB公司；轉染試劑FuGENE?HD購自Roche公司；G418購自Gibco公司；總 RNA 提取試劑盒 (MirVana miRNA Isolation Kit)，逆轉錄試劑盒 (TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit) 和實時定量PCR試劑 (TaqMan Universal Master Mix，No AmpErase?UNG) 均購自 ABI公司；豬抗CSFV陽性血清 (5號) 和陰性豬血清由本實驗室制備、鑒定并保存[18]；異硫氰酸熒光素(FITC) 標記的兔抗豬IgG抗體購自Sigma公司；實時定量 PCR儀 Stratagene Mx3000P購自Agilent公司；核酸測定儀 NanoDrop 1000購自Thermo公司。

1.2 轉染及抗CSFV的陽性細胞克隆鑒定

用Apal Ⅰ雙酶切質粒pLox-siN1、pLox-siN2和pLox-siC并乙醇沉淀回收含抗性基因neo的目的片段。用含10%小牛血清的MEM營養液以每孔2.0×105個PK-15細胞傳代于6孔細胞培養板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養20~24 h，使細胞貼壁生長滿度達到85%~90%，用FuGENE?HD轉染24 h后1∶50傳代于6孔細胞培養板中，培養24 h后換用500 mg/L G418的MEM培養基篩選 12~14 d，質粒 pLox-siN1、pLox-siN2和pLox-siC挑取細胞克隆 (分別命名為 PK-N1、PK-N2和PK-siC) 各3個至24孔板中培養，擴大培養并進行neo基因PCR鑒定 (引物neo-FP和neo-RP序列見表1)，以確定基因組中整合了目的基因片段。按以前所述方法[6]包括IFA (接毒后72 h)、病毒基因組拷貝數 (48 h和72 h) 和TCID50(48 h和 72 h) 測定以上陽性克隆抑制CSFV復制增殖的效果。

1.3 引物和MGB探針設計

參考 Chen等[16]和 Tang等[19]設計 siN1和siN2檢測用引物和探針 (表 1)：莖環引物由 5′端通用莖環結構序列 (5′-CTCAACTGGTGTC GTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3′) 和3′端與siRNA 3′端反向互補配對的siRNA特異性序列組成，根據與siRNA配對的寡核苷酸數量 (6或8個) 不同對每個siRNA設計了兩種莖環引物(分別為 SLP-N1-6、SLP-N1-8和 SLP-N2-6、 SLP-N2-8)。實時定量PCR上游引物包括用于提高 Tm值并延伸 PCR產物的 5′端通用序列(5′-ACACTCCAGCTGGG-3′) 和3′端siRNA特異序列。MGB探針由5′端6-FAM標記的通用序列 (5′-TTCAGTTGAG-3′) 和 3′端 MGB標記siRNA特異序列組成。選擇表達豐度較高且穩定的豬內源性ssc-miR16為內參，監測樣本質量、RNA提取及 RT-PCR等過程。所用引物均由南京金斯瑞基因有限公司合成，MGB探針由上海基康基因有限公司合成，標準品ssiN1 (人工合成的siN1，序列見表1) 由TaKaRa公司合成。

1.4 莖環法RT-qPCR

1.4.1 總RNA提取

將獲取的抗CSFV的PK-15細胞克隆培養于6孔細胞培養板中，當滿度達90%至95%時，棄培養液，用1 mL冷PBS在冰上洗細胞2次，然后按MirVana miRNA isolation kit說明書建議加入 500 μL裂解液裂解后提取總 RNA，以正常PK-15細胞為陰性對照。用NanoDrop 1000測定RNA濃度及質量，分裝于?80 ℃保存備用。

表1 siRNA及引物和MGB探針序列Table 1 Sequence of siRNA, primer and MGB probe

1.4.2 莖環法逆轉錄反應

逆轉錄反應體系包括50 nmol/L莖環引物，0.25 mmol/L dNTPs，3.33 U/μL逆轉錄酶，0.25 U/μL RNA酶抑制劑，1倍逆轉錄緩沖液，10 ng總RNA，用無RNA酶水補至15 μL。反應條件為冰上放置5 min，16 ℃ 30 min ，42 ℃延伸30 min，85 ℃酶滅活5 min，4 ℃保存。所有逆轉錄反應均為兩個重復。

1.4.3 實時定量PCR反應

實時定量PCR反應體系為10 μL PCR預混液，1.5 μmol/L上游引物，0.7 μmol/L通用下游引物，0.2 μmol/L MGB探針，1.2 μL cDNA產物，去離子水補至 20 μL。在 Agilent Stratagene Mx3000P實時定量PCR儀上完成反應，條件為：95 ℃熱啟動10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，在60 ℃收集熒光，共40個循環。所有反應包括陰性細胞對照 (NC) 和空白對照(NTC) 均為2個重復，結果取均值，產物連接T載體測序驗證。

1.4.4 標準曲線的繪制及靈敏度分析

為準確定量細胞克隆的siRNA表達水平，以10 mg/L濃度的PK-15細胞總RNA為稀釋液10倍梯度稀釋已知拷貝數的標準品ssiN1，取8個梯度 (拷貝數從 10到 1.0×108) 進行莖環法RT-qPCR檢測繪制標準曲線，計算細胞表達的siRNA拷貝數，并分析此方法檢測靈敏度。

1.4.5 特異性分析

因細胞表達數百種與siRNA大小相似的內源性 miRNA，可作為特異性分析材料，所以選擇PK-N1、PK-N2和 PK-siC細胞克隆及陰性細胞PK-15和PFF的總RNA為模板進行siN1和siN2的莖環法RT-qPCR檢測，以評價檢測特異性。

1.5 數據分析

用Agilent公司的Stratagene Mx3000P軟件分析 PCR結果。采取手動方式將閾值選定在固定熒光閾值 6000得到各反應管的 Cq值(Quantification cycle)，軟件自動生成標準曲線。用SPSS軟件完成數據統計分析。

2 結果

2.1 抗CSFV PK-15細胞克隆的制備及鑒定

將 G418篩選獲得的 PK-15細胞克隆進行neo基因PCR鑒定，均成功擴增出了neo基因片段 (圖略)，說明細胞克隆均整合了目的基因片段；抗CSFV檢測結果如圖1所示，IFA結果中陽性細胞克隆熒光比例為5%左右，遠遠低于對照細胞 PK-siC的 80%~85%，表明有效降低了CSFV抗原的合成；陽性細胞克隆的病毒基因組拷貝數和 TCID50測定結果均顯著低于對照細胞(P<0.01)，表明有效抑制了病毒基因組復制和成熟病毒粒子裝配。以上結果共同表明已成功獲得了抗CSFV的PK-N1和PK-N2細胞克隆。

2.2 莖環逆轉錄引物篩選

應用兩種莖環引物分別以相應陽性克隆、PK-15細胞的總 RNA 為模板進行莖環法RT-qPCR檢測。為篩選出最佳莖環引物，以具有較高逆轉錄效率且較低的背景信號為篩選原則，并引入 ΔCq進行量化評價，每種逆轉錄引物的ΔCq=Cq(陰性細胞對照) –Cq(陽性細胞克隆)，ΔCq越大，則逆轉錄引物具有越高的逆轉錄效率且產生越低的背景信號。結果如圖2所示，siN1檢測體系的莖環引物SLP-N1-6的ΔCq(7.09) 遠大于SLP-N1-8 (0.32)，siN2檢測體系的SLP-N2-8的ΔCq(10.48) 遠大于SLP-N2-6 (5.93)，所以均為最佳的莖環引物。

2.3 特異性分析

特異性分析結果如表 2所示，PK-N1和PK-15的siN2檢測結果相同，PK-N2和PK-15的siN1檢測結果也相同，說明siN1和siN2兩種檢測體系不會相互影響，均只能特異性地檢測各自目的siRNA；PK-siC和PK-15的siN1檢測結果相同，說明亂序的siN1分子不會影響siN1的檢測；而兩種陰性細胞PK-15和PFF的Cq均在35左右，且遠大于陽性克隆 (Cq為25-28)，說明檢測背景底，可通過 Cq的差異有效地區分陰陽性結果。以上結果共同表明我們建立檢測 siN1和siN2的莖環法RT-qPCR受內源性miRNA的干擾很小，具有很高的檢測特異性。

圖1 抗CSFV PK-15細胞克隆鑒定Fig. 1 Identity results of anti-CSFV cell clones. (A) IFA results of PK-15 cell clones at 72 h after CSFV infection (40×). Mock transfection: stained with CSFV-negative serum. (B,C) Quantity of CSFV genomic RNAs and infectious CSFV production at 48 h and 72 h after CSFV infection. PK-siC: PK-15 cell clones expressing scrambled siN1. ** P<0.01, very signifcant difference with PK-siC control.

圖2 莖環引物的篩選結果Fig. 2 Results of screening stem-loop primers. (A) 1, 3: PK-N1 RNA reverse transcribed with SLP-N1-8 (Cq=25.71) and SLP-N1-6 (Cq=28.14); 2, 4: PK-15 with SLP-N1-8 (Cq=26.03) and SLP-N1-6 (Cq=35.23). (B) 5, 6: PK-N2 RNA reverse transcribed with SLP-N2-8 (Cq=25.97) and SLP-N2-6 (Cq=31.82); 7, 8: PK-15 with SLP-N2-8 (Cq=36.45) and SLP-N2-6 (Cq=37.75).

2.4 標準曲線的繪制及靈敏度分析

以ssiN1為標準品繪制標準曲線，結果如圖3所示，1~7個梯度有很高的重復性，并能與陰性對照相區分，能檢測100個拷貝的siRNA；檢測線性范圍寬，可達 7個數量級；平行性好(Rsq=0.999)，擴增效率高 (Eff.=98.2%)；可對目的siRNA進行定量分析。

2.5 PK-N1和PK-N2細胞克隆的siRNA定量檢測

以經抗CSFV鑒定的PK-N1和PK-N2細胞克隆各3個進行siRNA定量檢測，用2-ΔCq法計算目的 siRNA相對于內參 ssc-miR16的表達水平，如表2所示，結果表明陽性細胞克隆PK-N1和PK-N2均表達了目的siRNA，但每個克隆的siRNA表達水平不同，最高為內參ssc-miR16的 5.54倍，最低的為0.62倍，通過標準曲線計算其拷貝數在 1.0×104左右。產物經測序鑒定正確，表明成功建立了可準確定量檢測siN1和siN2的莖環法RT-qPCR。

圖3 ssiN1檢測動態范圍及靈敏度分析Fig. 3 Dynamic range and sensitivity of the ssiN1 assay. (A) Amplification plot of ssiN1 over eight orders of magnitude. 1-8: ssiN1 input ranged from 10 to 1.0×108 copies; NC: negative control; NTC: no template control. (B) Standard curve of the ssiN1.

表2 陽性細胞克隆檢測及特異性分析結果Table 2 Results of positive cell clones and specificity analysis

3 討論

目前，RNAi已廣泛地應用于抗病毒治療研究，一般通過測定細胞接毒后病毒基因組拷貝數(Real time RT-PCR) 和蛋白表達水平 (IFA) 及成熟病毒粒子裝配水平 (TCID50)[4,6]來評價抗病毒效果，但在某些情況下定量檢測siRNA的表達水平是非常必要的。我們曾為確定siRNA四表達載體是否表達了每種siRNA而按ter Brake等[1]的方法構建了siRNA靶基因和報告基因GFP融合表達的報告質粒，與siRNA表達質粒共轉染細胞，可通過報告基因的表達來判斷siRNA是否表達及其抑制效果[6]。但這種間接的方法應用范圍窄，僅能評價siRNA載體的有效性，所以需要建立一種直接檢測siRNA的方法，以滿足廣泛的需要。

目前已有多種可用于檢測siRNA的方法，而選擇最適的方法是本實驗成敗的關鍵。熒光定量PCR是基因表達定量分析的金標準，盡管siRNA的短小對其提出了巨大挑戰，但仍有多種實時定量方法被開發出來[9-16]，這些方法兼具了實時定量 PCR的高靈敏度、高特異性、準確定量及寬動態范圍的實時監測等優點。而莖環法RT-qPCR因創新地設計了莖環引物，其莖部的堿基堆積作用大大增加了RNA-DNA雜交雙鏈的熱穩定性，另外，莖環的空間限制作用使之比常規線性引物有更高的特異性，并聯合特異性MGB探針，使其成為準確定量siRNA的最佳選擇。

在莖環引物的篩選過程中，我們發現對于siN1檢測體系 (圖2A)，用SLP-N1-8逆轉錄陽性細胞 (25.71) 和陰性細胞對照 (26.03) 的 Cq值基本相同，可能是體系中上游引物與莖環引物產生雜交反應，產生很高的假陽性信號，是不合格的引物；而 SLP-N2-6有較低的背景信號(35.23)，可有效區分陰陽性結果，是較理想的逆轉錄引物。對于 siN2檢測體系 (圖 2B)，無論SLP-N2-6 還是 SLP-N2-8的陰性細胞對照均有較低的背景信號，但 SLP-N2-8的陽性細胞(25.97) 的Cq遠小于SLP-N2-6 (31.82)，而這種信號不可能來自于較低的背景信號，所以說明SLP-N2-8有更高的逆轉錄效率，為較佳的逆轉錄引物。根據以上研究結果我們發現莖環引物的3′端與siRNA配對的堿基個數對實驗成敗至關重要，配對8個可能會與上游引物重疊導致雜交反應，造成假陽性結果，而配對6個又可能會降低逆轉錄效率，所以本實驗設計兩種莖環引物，以實驗來篩選效果最佳者，并引入ΔCq來進行量化評價，結果選擇了SLP-N1-6和SLP-N2-8為最佳莖環引物。

因為 siRNA和 miRNA均為21 nt左右的RNA分子，所以siRNA的檢測一般會受到細胞內源性數百種且表達量較高的miRNA的干擾。我們曾用Shi等[15]的Poly (A) 加尾法RT-qPCR檢測目的siRNA，但其陰性細胞對照及水對照均有擴增曲線 (數據未顯示)，可能是受miRNA的干擾所致，再加上引物二聚體與擴增產物的溶解曲線 Tm大小相近，給陰陽性結果的分析判斷帶來極大困難。而 Cheng等[17]報道了莖環法RT-qPCR也會產生非特異性曲線，他們設計的107個siRNA檢測體系，在以HeLa細胞RNA為陰性對照時，絕大多數體系 (101個) Cq值大于35，有5個Cq值在30至35之間，1個Cq值小于30，而陽性結果均小于 30，所以陰性細胞對照的Cq值大于35可說明體系有較低的非特異性擴增反應，不會影響目的siRNA的檢測。為了探明細胞內數百種 miRNA對我們所建立的siN1siN2檢測體系的影響，選擇了具有獨特miRNAs表達譜系的 PK-15和 PFF兩種陰性細胞，結果PK-15細胞 (見表2) 的Cq值均大于35，而PFF細胞的Cq值均在33到35之間，說明了細胞的miRNAs表達譜系會對檢測有所影響，但這種影響又是微乎其微的 (兩種陰性細胞僅相差1到2個Cq，而與陽性細胞相差7到10個Cq)，綜上結果表明，我們所建立的檢測siN1和siN2的莖環法RT-qPCR均有很高的檢測特異性。

為了準確定量細胞siRNA的表達水平，曾應用Promega公司的 Riboprobe System-T7系統體外轉錄的 siN1分子為標準品，但因無法準確測定siN1拷貝數而選擇了ssiN1，并用10 mg/L的正常PK-15細胞總RNA為稀釋液進行10倍梯度稀釋，模擬細胞內的真實環境，充分考慮了細胞內源性miRNA的干擾，以達到準確定量siRNA的目的。

雖然篩選獲得的抗CSFV細胞克隆均表達了目的 siRNA，但每個克隆的siRNA表達水平顯著不同，這可能是由于外源基因隨機地整合到受體細胞染色體的任意位置，產生了位置效應，也可能是隨機整合了多個外源基因所致。

本研究建立的莖環法RT-qPCR，可用于準確定量檢測細胞抗病毒 siRNA的表達水平，聯合IFA等檢測病毒水平的方法定量評價RNAi抗病毒的有效性。在抗豬瘟病毒轉基因動物的構建過程中，此方法可用于篩選siRNA高效表達的供體細胞克隆，從而提高抗病毒轉基因動物的成功率，并可應用于未來轉基因動物的抗病毒效果的評價。另外，本方法對siRNA、miRNA等小RNA的檢測工作具有很好的參考價值。

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