6羥基多巴誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞模型中Hsp60的定位表達(dá)研究

張靈 馮美江

帕金森病(PD)是老年人最常見的疾病之一。PD是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元減少為其主要病理特征。隨著對PD發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，人們越來越認(rèn)識到以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為主的免疫炎癥在PD發(fā)生及發(fā)展中的重要作用［1］。此外，近年來的研究表明，心肌梗死和神經(jīng)系統(tǒng)損傷后熱休克蛋白60(Hsp60)可從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，通過免疫炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷［2］。本研究將初步探討Hsp60在6羥基多巴(6-OHDA)誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞模型中的定位表達(dá)變化及其可能意義。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器PC12(腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系)細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。6-OHDA、維生素C(VitC)、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM高糖培養(yǎng)基(達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)、胰蛋白酶購自Sigma公司。胎牛血清購自Gibco公司，抗-Hsp60抗體購自Santa Cruz公司。熒光二抗、煙酸己可堿(Hoechst，用以染核)、Bio二抗購自Jackson公司。熒光倒置顯微鏡為Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%的胎牛血清、100 μg/ml青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，用0.25%的胰蛋白酶消化后，以2×105/ml密度接種于底面積25 cm2的培養(yǎng)瓶(15 ml/瓶)。

1.2.2 免疫印記(Western Blot)檢測：孵育24 h后，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(終濃度為100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(終濃度為0.002%)，分別繼續(xù)孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，經(jīng)與抗-Hsp60抗體(稀釋濃度為1∶500)和相應(yīng)的二抗(稀釋濃度為1∶1000)孵育，再用ECL試劑盒顯示蛋白。……