培養人眼小梁細胞水通道蛋白1與細胞外基質的相關實驗研究

彭 潔，張 虹

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院眼科，四川 成都 610072;2華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院眼科，湖北 武漢 430030)

細胞外基質是房水流出小梁網排出系統時的主要阻力。房水流出通道組織中細胞外基質異常沉積，將導致細胞間、細胞與基質間連接緊密，細胞骨架結構穩定、僵硬，同時沉積的細胞外基質堵塞小梁網，尤其阻塞Schlemm管的鄰管小梁網組織，使房水流出阻力增加，出現病理性眼內壓升高［1～3］。我們前期實驗中地塞米松(dexamethasone，DEX)能誘導小梁細胞水通道蛋白1(aquaporin-1，AQP1)表達改變［4］。DEX能使小梁網系統的細胞外基質分泌變化也已被多項研究證實［2，5］，那么該過程中，是否同時有AQP1參與，2010年6月至2011年12月本實驗就此作了初步探討，以揭示AQP1在小梁細胞上生理功能的相關機制。

1 材料與方法

1.1 人眼小梁組織 人眼小梁組織來源于意外死亡且無眼部疾患者，均于身故24小時內取材。該研究項目經四川省醫學科學院·四川省人民醫院倫理委員會批準，患者家屬詳知實驗目的和研究方案，均簽署了由該院倫理委員會批準的患者知情同意書。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養基(美國GIBCO公司)，胎牛血清(美國HYCLONE公司)，兔抗人AQP1多克隆抗體(美國CHEMICON公司)，兔抗人神經原特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)多克隆抗體，兔抗人纖維連接蛋白(fibronectin，FN)多克隆抗體，鼠抗人層粘連蛋白(laminin，LN)單克隆抗體，鼠抗人膠原蛋白 I(collagen I，CAI)單克隆抗體、鼠抗人膠原蛋白IV(collagen IV，CAIV)單克隆抗體、FITC熒光羊抗兔二抗，免疫組化試劑盒(北京中山生物技術有限公司)，AQP1反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODN)(北京賽百盛公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 人眼小梁細胞培養及鑒定 于無菌條件下，在角膜緣后5 mm處環形剪開眼球，去除玻璃體、晶狀體及葡萄膜，手術顯微鏡下找到小梁網，用眼科鑷順其方向撕下海綿狀小梁網，角鞏膜交界處可見位置很淺的鞏膜內溝。將小梁網剪成細小碎塊，接種于培養瓶或6孔培養板，置于含20%胎牛血清的DMEM-F12培養基中培養。原代培養采用3或4只眼的小梁組織。待融合后以胰蛋白酶消化、傳代培養，取傳3代細胞，于光學顯微鏡下觀察細胞形態，免疫組織化學法檢測NSE、FN、LN、CAI、CAIV等人眼小梁細胞特異性標記，鑒定人眼小梁細胞。

1.3.2 實驗分組與處理 DEX(美國SIGMA公司)用50%乙醇溶解，繼以DMEM/F12稀釋，除菌過濾后存于4℃冰箱備用，所含乙醇的最終濃度不超過0.05%，不影響細胞的分裂增殖。AQP1AS-ODN，5'-CAGCCCTCCAGAAGAGCTTCTTCTT-3'，用來減少培養小梁細胞AQP1的表達，5'端頭9個堿基和3'端尾7個堿基被硫化修飾。傳三代的細胞用于實驗，傳于放有載玻片的培養板中，待細胞接近融合，將培養孔隨機分成6組，每組32孔。對照組(A組)不加藥，其余每 組分別給 予 DEX(SIGMA，美國)0.4 μg/ml(B組)、DEX 0.4 μg/ml+AQP1ASODN 0.625 μg/ml(C組)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 1.25 μg/ml(D組)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 2.5 μg/ml(E組)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 5 μg/ml(F組)。第3天換培養基和重新給予同樣藥物。

1.3.3 免疫組化檢測FN、LN、CAI及CAIV 5天后，載玻片取出，1∶1丙酮和酒精固定，PBS漂洗。正常山羊血清封閉非特異背景孵育30 min，傾去血清。分別依次滴加PBS稀釋的一抗即抗FN、LN、CAI及CAIV抗體，4℃冰箱過夜，與一抗相對應的生物素標記的二抗IgG，辣根酶標記鏈霉卵白素。DAB顯色，蘇木素復染，過鹽酸酒精，1‰氨水，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。空白對照組則加入PBS代替一抗，余操作步驟同。封片后每張切片隨機選5個視野輸入計算機，經計算機圖像分析處理系統在同一光強、同一放大倍數下，檢測每個視野中邊界清晰、胞漿互不重疊的人眼小梁細胞核周棕黃色區域的吸光度(A值)，每種濃度重復檢測3次。

1.4 統計學方法 所有數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行處理，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析和q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人小梁細胞培養及特征 原代接種培養經過2周左右的潛伏期，細胞由組織塊長出，形態不規則，呈內密外疏的單層生長，經8～12天細胞融合，融合時呈放射狀、旋渦狀，細胞體緊密連接，無重疊生長。傳代。FN、LN、CAI、CAIV及NSE免疫組織化學染色陽性，結合細胞的生長過程、形態學觀察及免疫組織化學特性，所培養的細胞符合人眼小梁細胞特征。

2.2 DEX、AS-ODN對小梁細胞FN、LN、CAI及CAIV表達的影響 結果顯示培養的人眼小梁細胞可以合成、分泌FN、LN、CAI及CAIV。0.4 μg/ml地塞米松能刺激培養小梁細胞FN、LN及CAIV表達明顯增強，使CAI表達減少，均與對照組相比差異有顯著性意義。在C、D、E、F各組，AQP1AS-ODN可以降低由0.4 μg/ml地塞米松引起的FN、LN、CAIV表達增強，隨著AQP1AS-ODN濃度的逐步加大，可將FN、LN、CAIV表達量降至接近正常對照組，在 LN類，甚至低于正常對照組。同時，AQP1AS-ODN可以增加由0.4 μg/ml地塞米松引起的CAI表達減少，隨著AS-ODN濃度的逐步加大，可將CAI表達量增至接近正常對照組。FN類，B組與A組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，C、D、E、F組與A組比較差異無統計學意義。LN類，A、D組與B、C組與E、F組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。CAI類，B組與A組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，C、D、E、F組與A組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。CAIV類，B、C、D組與A組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，E、F組與A組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。各組平均吸光度A值見表1，圖1～圖4。

表1 5天后，各組小梁細胞細胞外基質平均吸光度A值

圖1 FN在人眼小梁細胞的表達(×200)a:對照組，b:DEX 0.4 μg/ml組，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml組;圖2 LN在人眼小梁細胞的表達(×200)a:對照組，b:DEX 0.4 μg/ml組，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml組;圖3 CAI在人眼小梁細胞的表達(× 200)a:對照組，b:DEX 0.4 μg/ml組，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml組;圖4 CAIV在人眼小梁細胞的表達(×200)a:對照組，b:DEX 0.4 μg/ml組，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml組

3 討論

3.1 小梁細胞外基質中FN、LN、CAI及CAIV參與激素性青光眼的發病 小梁網由若干小梁帶組成。小梁帶是有很強變應性和彈性的組織，其軸心是由CAI和CAIII及彈力硬蛋白組成的膠原軸，膠原軸外環繞由CAIII、CAIV、CAV、FN和肝素硫酸鹽糖蛋白構成的基質層，呈低電子密度的均質狀，其最外層由小梁網內皮細胞包繞［6］。對正常眼和原發性開角型青光眼小梁網和Schlemm管基底膜中CAIV、FN及LN超微結構的特點、成分及定位的研究表明，二者是類似的［7］。

CA是構成細胞外基質的主要蛋白質。CAI為條紋膠原，存在于小梁核心、小梁柱和近小管的組織。CAIV分布于基底膜。CA的特征是形成不溶性纖維而具有高度的抗張性。如果CA的功能或數量發生異常，必將影響到細胞外基質結構和小梁網的篩狀結構，從而影響到房水的排出。非膠原糖蛋白主要有 FN和 LN，兩者對細胞粘著起重要作用［8，9］。二者是基膜的主要結構成分，在生物過程中扮演著重要的角色，包括細胞附著和傳遞、分化、遷徒和傷口治愈。FN通過細胞膜與微絲束聯系。細胞一般不直接與CAIV或蛋白聚糖結合，而是通過LN將細胞固定于基膜上。FN是細胞外基質中的重要成分，主要起黏附作用，可分別與不同的大分子或細胞結合，包括膠原、肝素、纖維蛋白、肌動蛋白、轉化增強因子、DNA等，同時FN與膜下微絲在細胞與底層接觸區形成跨膜聯系，從而影響細胞骨架排列，且對細胞有趨化和調理并加促增殖等作用［10］。有人測得牛眼房水流出道中FN濃度比血漿中低100倍，而在原發性開角型青光眼的患者眼前房流出道中濃度明顯增加，尤其是在Schemm管內壁和近管組織。如果小梁細胞合成和分泌這兩種蛋白濃度增加而降解酶即纖維蛋白溶酶原不增加，必將引起這兩種蛋白在小梁網房水流出道中堆積，阻塞小梁網眼結構，使房水排出受阻。其中FN的增加是進行性的，有學者發現，同樣情況下，人眼小梁細胞對FN的表達存在個體差異。DEX誘導下，激素敏感者表達增加，除去誘導后不可逆，但可被糖皮質激素拮抗劑部分拮抗。DEX引起細胞外基質中FN、LN的表達增加，提示二者堆積參與了激素性青光眼的發病。

3.2 AQP1參與DEX誘導的細胞外基質變化 我們的實驗結果提示，DEX誘導細胞外基質中FN，LN、CAIV的表達增加，CAI表達減少。我們前期研究提示，0.4 μg/ml可以使AQP1表達較大限度的增多［4］，這與卓業鴻等［11］的研究結果是相似的，故選擇用0.4 μg/ml的DEX作為AQP1表達增多的誘導劑來處理培養的人眼小梁細胞。實驗在0.4 μg/ ml DEX誘導的同時，給予AQP1AS-ODN作用，旨在消除DEX所導致的AQP1表達增多帶來的影響，檢測AQP1AS-ODN施予前后的細胞外基質變化，探討排除AQP1影響后的細胞外基質的表達，研究AQP1是否參與 DEX增加細胞外基質分泌的過程。AQP1AS-ODN是基因水平上AQP1的抑制劑，它特異阻斷細胞內AQP1的轉錄與翻譯。結果表明，AQP1AS-ODN在濃度用到合適的劑量時，均能逆轉0.4μg/ml DEX所誘導的細胞外基質變化的現象。AQP1AS-ODN可以降低由0.4 μg/ml DEX引起的FN、LN、CAIV表達增加，隨著其濃度的逐步加大，可將FN、LN、CAIV表達量降至接近正常對照組。在LN類，甚至低于正常對照組，這可能是影響了其它復雜機制。同時，AS-ODN可以增加由0.4 μg/ml DEX引起的CAI表達減少，隨著AS-ODN濃度的逐步加大，可將CAI表達量增至接近正常對照組。這些都提示AQP1或以細胞膜水轉運蛋白，維持細胞正常生理功能的角色，或以作用于AQP1啟動子中糖皮質激素反應元件等角色參與了DEX增加細胞外基質分泌的過程。

如果我們在激素性青光眼的治療中考慮到這一點，結合我們其它對AQP1的生理功能研究，深入AQP1在人眼小梁細胞的其它離體或在體研究，在以后科研及臨床中加以明確其意義，我們將會為青光眼的防治帶來新局面。

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