成人牙面色素沉積與口腔產黑菌關系的研究

張明珠，稅艷青，呂罕鮮，任曉斌，黃松靖，王小潔

(云南昆明:1.昆明醫學院附屬口腔醫院口腔內科，650031;2.省第一人民醫院口腔預防科，650032)

口腔色素沉積是一種常見的影響口腔健康和美觀的因素之一。正常牙為淡黃半透明的象牙色，其顏色的改變常由兩種原因造成:一種是由于外來色素在牙齒表面沉積，稱外源性著色;另一種是由于牙齒本身的原因或全身性病造成的色澤改變，稱為牙齒變色或內源性著色。外源性著色常見原因有:食用含色素的物質、特殊工種從業人員長期接觸的無機鹽和化學物質、口腔中的產色素細菌感染等。

大量研究表明口腔產黑菌有產生黑色素的功能［1-3］，其中產黑色素類厭氧桿菌(Black-Pigmented Anarobic Bod，BPB)是一組從口腔分離的G-厭氧桿菌，包括牙齦卟啉單胞菌(Pg)、牙髓卟啉單胞菌(Pe)、中間普氏菌(Pi)和變黑普氏菌(Pn)等［4］。臨床研究發現:BPB能夠通過吸附裝置粘附于黏膜、齦溝上皮細胞表面，與宿主相互作用，影響口腔衛生健康。

雖然BPB能夠產生黑色素，但目前關于BPB與口腔內色素沉積之間的關系報道甚少，本研究將對此進行初步研究，為臨床制定控制色素的對策提供參考。

1 材料和方法

1.1 受試對象選擇

從昆明醫科大學附屬口腔醫院口腔綜合科選擇18～40歲牙面有色素沉積的志愿者30人(均為非吸煙和非食用含色素物質者，色素沉積面積超過牙頸1/3，達冠中1/3以上);同時選擇18～40歲牙面無色素沉積的志愿者30人作為對照。所有受試者均排除齲病、非齲性病和牙齦炎，3個月內未使用過抗生素，知情同意。

1.2 牙菌斑標本采集

分別用探針采集每個受試者混合牙菌斑1 mg，立即放入含1 mL硫乙醇酸鹽傳輸液的離心管內，-20℃保存備用。

1.3 菌斑內4種產黑色素類桿菌的檢測

1.3.1 DNA抽提

分別取上述凍存的所有菌斑樣本，經凍融后10 000 g離心3 min棄上清，使用QIAGEN DNA Mini kit試劑盒提取菌斑DNA(抽提過程按廠商說明)(表1)。

表1 引物序列和產物［5］

1.3.2 PCR擴增反應

采用二步PCR法對樣本進行擴增:①首先利用細菌通用引物［5］，產生全長的16S-rDNA產物，再以該產物為模板，采用細菌特異引物擴增相對應的目標細菌DNA(引物序列和退火溫度參見表1);②PCR反應，反應體系 50 μL:3 μL dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol/L)，5 μL 10 ×bufferⅡ，0.5 μL DNA Polymerase(5 U/μL)，特異引物各0.5 μL(25 mmol/L)，模板1 μL，去離子水加至50 μL;③PCR反應條件為:一步擴增條件: 97℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環;二步擴增條件:95℃變性1 min，退火30 s，72℃延伸30 s，26個循環。最后72℃優化7 min;④擴增產物使用含0.5 μg/mL溴化乙錠液的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳40 min(恒壓6V/cm)，紫外燈觀察目標片段大小是否符合理論值的PCR產物。并計算各組各種細菌的檢出率。

1.4 統計學分析

實驗組與對照組各菌檢出率比較用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果(表2，圖1)

表2 各組4種細菌的檢出率比較 (%)

圖1 Pg、Pe、Pi、Pn PCR檢測電泳圖

全部樣本至少有一種目標細菌被檢出，大多數樣本以細菌混合感染為主，無色素沉積的標本中Pg、Pe、Pi、Pn檢出率分別為27%、40%、30%、87%;有色素沉積樣本中檢出率分別為 60%、80%、73.3%、80%。統計學分析顯示:有色素沉積者Pg、Pe、Pi的檢出率明顯高于無色素沉積者(P＜0.05)，Pn二組無統計學差異(P＞0.05)。

3 討論

大量研究表明:BPB與牙髓感染、牙周炎都相關［6］，Pg、Pe、Pi、Pn在髓腔未暴露的慢性根尖周炎中的檢出率分別為36.67%、50%、16.67%、43.33%;在髓腔未暴露的牙髓炎檢出率分別為20%、36.67%、10%、20%［7］。本研究中上述4種細菌在色素沉積組的檢出率分別為60%、80%、73.3%、80%，明顯高于感染根管內的檢出率，表明開放口腔內的細菌量和細菌種類多于封閉的根管，牙面色素沉積可能與這幾類產黑菌定植有關。

目前，雖然對BPB在牙面色素沉積方面的研究甚少，但有些間接研究表明:外源性著色，特別是與血紅素相關的色素沉積與產黑菌有關，Smalley［1］研究表明，Pg的牙齦素成分與高鐵血紅蛋白形成有關，高鐵血紅蛋白則與二聚血紅色素形成有關;高鐵血紅蛋白可以有效阻礙血紅素溶解，防止血紅蛋白消退，所以牙齦素可促進血紅素的形成。此后Smalley［8］(1998)研究又發現:Pg精氨酸和賴氨酸特異性牙齦蛋白酶與血紅蛋白的降解有關，氧化血紅蛋白與Pg精氨酸特異牙齦蛋白酶-R結合可導致高鐵血紅蛋白的形成，高鐵血紅蛋白被特異牙齦蛋白酶K降解，最終導致原卟啉鐵的釋放，從而促進色素形成。Pi和Pn在低pH值環境中，可形成高鐵血紅蛋白并降解產生卟啉鐵，低pH值又可導致不溶性卟啉鐵的沉積，從而促進色素沉積［3，8］。本研究在排除主要通過食物性色素來源的情況下，分別對30例有色素和無色素沉積者的菌斑樣本進行檢測，發現有色素沉積者菌斑樣本中Pg 18(60%)、Pe 24(80%)、Pi 22(73.3%)的檢出率明顯高于無色素沉積者，提示這幾類產黑菌可能與非食物性牙面色素沉積有密切關系。

［1］ Smalley JW，Birss AJ，Szmigielski B，et al.Mechanism of methaemo-globin breakdown by the lysine-specific gingipain of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis［J］.Biol Chem，2008，389(9):1235-1238.

［2］ Smalley JW，Birss AJ，Szmigielski B，et al.Sequential action of R-and K-specific gingipains of Porphyromonas gingivalis in the generation of the haem-containing pigment from oxyhaemoglobin［J］.Arch Biochem Biophys，2007，465(1):44-49.

［3］ Smalley JW，Silver J，Birss AJ，et al.The haem pigment of the oral anaerobes Prevotella nigrescens and Prevotella intermedia is composed of iron(Ⅲ)protoporphyrin IX in the monomeric form［J］.Microbiol，2003，149(Pt7):1711-1718.

［4］ 劉正.口腔生物學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2007:70-82.

［5］ Siqueira JF Jr，R??as IN，Alves FR，et al.Selected endodontic pathogens in the apical third of infected root canals:a molecular investigation［J］.J Endod，2004，30:638-643.

［6］ 嚴杰，陳莉麗，朱仲珍，等.牙周炎患者齦下厭氧菌的分離和鑒定［J］.浙江醫科大學學報，1993，3(22):122-124.

［7］ 劉海霞.產黑色素類桿菌在感染根管內的研究［D］.長沙:中南大學碩士學位論文，2008.

［8］ Smalley JW，Silver J，Marsh PJ，et al.The periodontopathogen Porphyromonas gingivalis binds iron protoporphyrin IX in the mu -oxo dimeric form:an oxidative buffer and possible pathogenic mechanism［J］.Biochem J，1998，331(Pt 3):681-685.