組蛋白去乙酰化酶1、3在炎癥牙周膜中的表達

肖 蕊，劉大勇，趙夢明，荊曉艷，賈 智

(天津醫科大學口腔醫院，天津300070)

組蛋白乙酰化屬于表觀遺傳學的范疇，是一種不涉及DNA序列改變的可遺傳的基因表達變化過程［1］。組蛋白乙酰化狀態受兩類酶 — 組蛋白乙酰化轉移酶(histone acetyltransferases，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)的調節［2］。組蛋白乙酰化和去乙酰化作用是調節炎癥反應中基因表達的重要過程，有研究表明，HDAC是參與炎癥基因轉導和細胞增殖的關鍵因子［3］。哺乳類HDAC可分為4組，共18種:組I (HDAC 1、HDAC 2、HDAC 3、HDAC 8)在大多數細胞中普遍存在，主要位于細胞核，調控組蛋白的乙酰化修飾;組Ⅱ(HDAC 4、HDAC 5、HDAC 6、HDAC 7、HDAC9、HDAC10)常頻繁穿梭于細胞核內和胞漿之間，調控組蛋白和非組蛋白的乙酰化修飾;組Ⅲ(Sirt 1、Sirt 2、Sirt 3、Sirt 4、Sirt 5、Sirt 6、Sirt 7)能夠使p53去乙酰化，從而導致p53介導的轉錄、凋亡等一系列生物學活動失去作用;組Ⅳ(HDACll)可能與免疫耐受有關。

牙周炎是牙周組織慢性感染性疾病，是成人失牙的主要原因，并且與許多全身性病相關，如糖尿病、心血管疾病、新生兒早產和低體質量兒等。牙周炎的發生過程是以牙周致病菌為始動因子而引起的機體過度免疫反應，并最終導致牙周組織破壞。研究證實，牙周炎免疫反應具有自身免疫反應的特征［4］，且在發病機制、治療等方面與類風濕性關節炎有許多相似之處［5－6］。

與骨關節炎和正常滑膜組織相比，類風濕性關節炎中的HDAC 1過表達［7］。研究表明［8］:一種新型HDAC 3選擇性抑制劑－MI192能減少類風濕性關節炎患者外周血單核細胞(PBMC)中IL－6的產生，從而緩解其免疫炎癥反應。然而，牙周炎的發生與牙周組織中乙酰化狀態的改變是否有關尚未見報道。本研究通過比較炎癥牙周膜與健康牙周膜中HDAC 1、HDAC 3的表達，初步探討HDAC與牙周炎發病的關系。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

TransZol Up、TransScript Two－Step RT－PCRsuperMix、DNAmarker(全式金，北京);引物(上海生工);瓊脂糖、梯度PCR儀(MJ Research公司，美國);電泳凝膠成像儀(Vitbertourmat公司，法國)。

1.2 組織樣本采集

所選病例均來自天津醫科大學口腔醫院門診患者，實驗組選擇20～55歲慢性牙周炎患者20例，納入標準:①探診深度(PD)≥5 mm，臨床附著水平(CAL)≥5 mm，X線片示牙槽骨吸收≥根長的1/2;②牙齒松動≥Ⅲ度，需要拔除患牙。排除標準:①藥物、妊娠等導致的牙齦增生;②患有糖尿病等全身性病;③吸煙者。對照組選擇20～55歲牙周健康［探診深度(PD)≤3 mm，無附著喪失，無牙齦出血或紅腫］者20例，均無全身性病，不吸煙且有需要拔除的正畸減數牙或智齒。收集符合以上標準的所有受試者被拔除的牙齒，并刮取根中1/3牙周膜組織置無酶無菌的凍存管內，液氮罐中保存備用。

1.3 RT－PCR檢測炎癥及健康牙周膜中HDAC 1，HDAC 3的表達

1.3.1 引物合成

HDAC 1上游引物:5'－AGCCAAGAGAGTCAAAACAGA－3';下游引物:5'－GGTCCATTCAGGCCAACT－3';產物長度102 bp。HDAC 3上游引物:5'－TGGCTTCTGCTATGTCAACG－3';下游引物:5'－GCACGTGGGTTGGTAGAAGT－3';產物長度308 bp。GAPDH上游引物:5'－GTCAGTGGTGGACCTGACCT－3';下游引物:5'－AGGGGAGATTCAGTGTGGTG－3';產物長度413 bp。以上引物均由上海生工生物技術公司合成。

1.3.2 提取總RNA

將上述凍存的組織樣本轉移至液氨預冷的研缽中，研磨至粉狀后，每50～100 mg組織中加入1 mL TransZol繼續研磨。然后轉移至EP管，室溫靜置 5 min，加入 0.2 mL氯仿劇烈震蕩，12 000 r/min 4℃離心15 min，取無色水相上層;加入0.5 mL異丙醇析出沉淀，12 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清;用1 mL無RNA酶的750 mL/L乙醇洗滌沉淀，7 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，室溫干燥形成膠狀沉淀。將膠狀沉淀用10 μL RNA溶解液溶解后，取1 μL稀釋100倍，用紫外分光光度計分別測定280 nm和260 nm處的吸光度值(OD)，以評定其濃度和純度。最后根據測定值調整RNA標本濃度為1 μg/μL。

1.3.3 cDNA第一鏈合成和多聚酶鏈反應(PCR)

嚴格按照TransScript Two－Step RT－PCR super-Mix試劑盒說明進行。首先合成cDNA第一鏈，合成體系20 μL:總RNA50 ng～5 μg;Anchored OLigo 1 μL;2×TS Reaction Mix 10 μL;TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，Rnase－free Water to 20 μL。然后PCR擴增HDAC 1、HDAC 3和內參GAPDH。

PCR反應體系25 μL:cDNA 1 μL;上游引物1 μL;下游引物1 μL;2×TransTaqTM HiFi PCR SuperMix 12.5 μL;ddH2O 8.5 μL。反應條件為: 94℃變性5 min后，94℃變性30 s，HDAC1，56℃; HDAC 3，59℃;GAPDH，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環后72℃再延伸10 min。PCR產物行溴化乙啶染色(EB染色)瓊脂糖凝膠電泳，觀察并照相。

1.3.4 灰度值分析

用Quantity One軟件對電泳圖進行灰度值分析，以樣品灰度值與同一樣品GAPDH的灰度值之比作為評價HDAC 1，HDAC 3表達量的指標。

1.4 統計學分析

用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，實驗組和對照組比較用獨立樣本的t檢驗，檢驗水準α= 0.05。

2 結果

在炎癥牙周膜和健康牙周膜組織中均有HDAC1、HDAC 3表達(圖1)。經灰度值分析，HDAC1、HDAC3在炎癥牙周膜中的表達均明顯高于健康牙周膜，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖2)。

圖1 炎癥和健康牙周膜中HDAC 1、HDAC 3的表達

圖2 炎癥、健康牙周膜中HDAC 1、HDAC 3相對灰度值比較

3 討論

由于核心組蛋白富含帶正電荷的堿性氨基酸，與DNA具有高度親和性，能阻礙基本轉錄單位蛋白質復合物進入啟動子結合位點，而導致轉錄功能受到抑制。組蛋白氨基末端特定部位ε－氨基酸的乙酰化可中和其正電荷，減弱核小體中堿性氨基酸與DNA的靜電吸引力，增加轉錄因子的進入，從而促進基因的轉錄。因此，組蛋白的乙酰化和去乙酰化與基因的表達調控密切相關。負責組蛋白乙酰化和去乙酰化的是兩種功能相互拮抗的蛋白酶HAT和HADC，兩者之間的動態平衡控制著染色質的結構和基因的表達。當HDAC過度表達并被轉錄因子募集，就會導致特定基因的不正常抑制，從而導致炎癥性自身免疫病等其他疾病。

乙酰化修飾在炎癥性自身免疫性疾病中起重要作用，其中包括組蛋白乙酰化修飾和非組蛋白乙酰化修飾。組蛋白乙酰化修飾是基因轉錄激活的重要標志。當炎癥信號傳至核內、轉錄因子與啟動子結合后，可進一步募集P300/CBP等共刺激因子，他們作用于組蛋白N端的賴氨酸殘基使其發生乙酰化修飾［9］。非組蛋白的乙酰化修飾包括NF－КB等的乙酰化修飾。近期研究發現，乙酰化等翻譯后修飾在NF－КB的亞細胞定位、DNA結合力、轉錄活性等方面起重要調節作用［10］。當炎癥刺激因子作用于機體時，P38等MAPK信號通路的激活可磷酸化P300并激活HAT活性，還可乙酰化P65，增加NF－КB與КB序列的結合能力啟動NFКB介導的炎癥相關基因轉錄［11］。IL－1、IL－6啟動子上均有NF－КB結合位點，其基因轉錄受NF－КB調控，NF－КB活化后促進炎癥因子基因轉錄從而增加炎癥相關蛋白的表達［12］。有研究發現: HDAC 1、HDAC 3可直接或間接與NF－КB結合，在NF－КB去乙酰化中發揮一定作用［13－14］。

本結果顯示:牙周炎患者牙周膜中HDAC 1、HDAC 3 mRNA表達明顯高于牙周健康者(與類風濕性關節炎研究類似［7－8］)，打破了組蛋白乙酰化和去乙酰化的動態平衡，有可能促進了NF－КB介導的炎癥因子的表達，參與了牙周炎癥反應的基因調控。

研究證實:由于可以減少炎癥因子的產生，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deactylase inhibitor，HDACi)在體內外具有免疫調節作用［15－16］。HDACi可以調節NF－КB信號通路，從而降低炎癥因子和轉錄因子的水平［17－18］。HDACi已被用于治療多種炎癥性自身免疫病，包括類風濕性關節炎、哮喘、銀屑病、多發性硬化病、系統性紅斑狼瘡等［19－20］。局部用藥能降低系統毒性和有關的副作用［21］。局部應用組蛋白去乙酰化抑制劑可能會為牙周炎治療開辟一條新途徑。

總之，本研究發現HDAC 1、HDAC 3在炎癥牙周組織中高表達，該結果雖初步從表觀遺傳學的角度探索了牙周炎可能的發病機制，但組蛋白乙酰化和去乙酰化過程調控牙周炎癥免疫反應的確切機制，以及組蛋白去乙酰化酶抑制劑能否成為牙周炎治療的潛在藥物，還需進一步研究證實。

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