牙齦卟啉單胞菌侵入口腔上皮細胞后基因表達變化的初步研究

成 偉，王 潔，孔令雪，齊 霞，吳亞菲，趙 蕾

(四川成都610041:1.四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室;2.四川大學華西口腔醫院牙周科)

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是一種可破壞牙周組織的G－專性厭氧菌，它廣泛存在于慢性牙周炎患者的齦下菌斑中，是公認的牙周主要致病菌［1］。Pg對齦溝內牙齦上皮細胞的粘附和侵入作用是細菌引發牙周炎的關鍵性起始步驟之一。在單純培養狀態下與感染宿主細胞過程中，Pg表達的基因存在顯著差異。提示該菌與牙齦上皮細胞的感染接觸作用可能是誘導其多種致病基因表達的重要調控信號，能幫助Pg完成粘附及侵入、逃逸宿主防御攻擊、誘導宿主細胞炎癥介質表達等致病過程。KB細胞株是目前國際通用的牙齦上皮細胞替代細胞模型之一，其增殖頻率和活性穩定，與Pg相互作用的方式類似于牙齦上皮細胞［2－6］，被廣泛應用于牙周致病菌與宿主細胞的相互調控研究中。本研究利用 Pg ATCC 33277攻擊KB細胞，采用差異顯示反轉錄PCR技術(differential display reverse transcription PCR，DDRT－PCR)，比較Pg侵入KB細胞后與純培養狀態下細菌全基因組的基因表達變化，初步篩選并分析與細菌侵入宿主細胞相關的毒力致病基因，以期為后續Pg特異性毒力因子的明確和功能分析提供依據。

1 材料和方法

1.1 菌株、細胞株和主要試劑、儀器

Pg ATCC 33277、KB細胞株ATCC CCL17(四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室);BHI培養基(OXIOD，英國);細菌RNA提取試劑盒Ribo-PureTM－Bacteria Kit(Ambion公司，美國);引物、cDNA逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(大連TaKaRa公司);2×Taq PCR MasterMix PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司);梯度PCR儀(Eppendorf，德國);Gel－Doc2000凝膠成像觀察系統(Bio－Rad，美國);透射電鏡(H－600IV HITICHI，日本)。

1.2 牙齦卟啉單胞菌與KB細胞共培養

取Pg ATCC 33277常溫復蘇后，接種于BHI血瓊脂培養基(含5%凍溶兔血、1%血紅素和維生素K)，37℃厭氧(800 mL/L N2、100 mL/L H2、100 mL/L CO2)培養48 h。革蘭染色和生化鑒定為純培養后，挑取菌落接種于BHI液體培養基繼續厭氧培養24 h。培養物經6 000 r/min離心8 min去上清，用不含胎牛血清和雙抗的低糖DMEM培養基重懸，麥氏比濁儀調整細菌懸液濃度至1×108CFU/mL備用。常規復蘇KB細胞株ATCC CCL17并接種于低糖DMEM(100 mL/L FBS+1%青霉素/鏈霉素)中，飽和濕度、50 mL/L CO2、37℃標準環境中培養并傳代1～2代，鏡下觀察細胞形態呈“鋪路石”狀，在長滿瓶底80%時，用含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化，調整細胞密度為2×105/mL，以每孔2 mL接種于6孔板繼續培養。24 h后每孔細胞數增殖為5×105/孔，將上述配置好的Pg菌懸液(1×108CFU/mL)1 mL加入6孔板各孔內，使細菌攻擊細胞MOI值為200∶1，標準條件下共同孵育18 h并經透射電鏡觀察確認Pg成功侵入KB細胞后，PBS清洗3次以去除未粘附Pg，收集細胞備用。

1.3 Pg總RNA的提取和cDNA的合成

常規厭氧培養18 h的Pg ATCC 33277菌液調整濃度為1×108CFU/mL，取1mL菌液8 000 g 4℃離心2 min后棄上清，PBS清洗3次后備用;將已去除未粘附細菌的KB細胞用去離子冰水裂解20 min，加入含1 mmol/L MgCl2、0.5 mg/mL DNA酶和0.25 mg/mL RNA酶的PBS液浸泡30 min，去除KB細胞的DNA和RNA，收集樣本于1 mL的EP管中。上述樣本用RiboPureTM－Bacteria Kit細菌RNA提取試劑盒按照說明書操作步驟分別提取純培養和侵入KB細胞的Pg的總RNA。10 g/L的瓊脂糖電泳(90 V，80 mA)檢測RNA質量。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒，根據說明書逆轉錄細菌RNA成cDNA，于－20°凍存備用。

1.4 差異顯示反轉錄DDRT－PCR(表1)

選取不同的錨定引物和隨機引物配置成不同組合(共12種)進行PCR反應。PCR總反應體系為:4μL 模板、錨定引物和隨機引物(0.01 mmol/L)各1 μL、MIX酶12.5 μL、無菌三蒸水補足體積至25 μL。將細菌攻擊細胞前后的cDNA作為一組進行反應。PCR反應在PCR熱循環擴增儀完成，PCR程序為:94℃ 60 s，94℃ 60 s，40℃120 s，72℃60 s，1個循環;94℃45 s，60℃ 120 s，72℃120 s，35個循環;72℃7 min延伸。

表1 DDRT－PCR所用的錨定引物及隨機引物序列

1.5 差異條帶回收、二次擴增、測序和BLAST分析

取DDRT－PCR產物各15 μL，以100 bp為分子量標記，20 g/L的瓊脂糖凝膠做電泳分析，顯示差異表達片段。將差異片段按照膠回收試劑盒進行cDNA回收，將回收得到的cDNA應用相應引物再次進行DDRT－PCR擴增，擴增產物送至寶生物工程(大連)有限公司測序。所獲得條帶的cDNA序列數據，在GENEBANK中與Pg ATCC 33277和Pg W83的基因組已知核苷酸序列進行比對，行BLAST同源分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sutils/genom_table.cgi，http://www.oralgen.lanl.gov/)。

2 結果

2.1 侵入KB細胞后Pg ATCC 33277 RNA提取結果(圖1)

侵入KB細胞前后Pg ATCC 33277的RNA樣品電泳條帶清晰，泳道上無明顯彌散痕跡，其中23S∶16S rRNA條帶亮度比值約為2∶1，說明總RNA提取完整無降解，滿足后續實驗要求。

圖1 侵入KB細胞前后Pg總RNA的電泳結果

2.2 差異顯示反轉錄DDRT－PCR的電泳結果(圖2)

侵入KB細胞后Pg ATCC 33277的cDNA經DDRT－PCR擴增后均得到清晰的擴增條帶。其中第1、2泳道的擴增引物為A*ARP2;3、4泳道為C*ARP2;5、6泳道為C*ARP4。泳道1、3、5為攻擊細胞后Pg cDNA擴增產物，2、4、6為純培養Pg cDNA擴增產物。電泳結果顯示:與2泳道相比較，1泳道存在差異條帶HX 01;與4泳道比較，3泳道存在差異條帶HX 02，與6泳道相比，5泳道存在差異條帶HX 03。

圖2 Pg ATCC 33277侵入KB細胞前后DDRT－PCR結果

2.3 差異片段的BLAST序列分析

差異條帶cDNA應用相應引物二次擴增后，擴增產物測序結果顯示:PGHX 01序列共645 bp，經BLAST分析發現，PGHX01與Pg 33277的PG0683序列有96%的基因同源性，PG 0683編碼ABC轉運蛋白(ATP－binding cassette transporters);PGHX 02序列共351 bp，BLAST分析與PG 0159存在97%基因同源性，PG0159編碼Pg PepO;PGHX03序列共738 bp，BLAST分析結果顯示未發現類似基因序列片段(表2)。

表2 DDRT－PCR差異表達片段的BLAST同源性分析結果

3 討論

牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎的重要致病菌之一，具有多種毒力因子，細菌對宿主細胞的粘附和侵入能力是衡量其致病力的重要指標之一。研究顯示［7－9］:Pg在與牙齦上皮屏障接觸的15 min之內即可粘附并侵入宿主細胞;胞內細菌通過抑制細胞凋亡為自身創造有利于胞內生存的時間和空間條件，侵入24～48 h后達到胞內復制高峰;并通過調節細胞自吞噬循環通路逃離原駐細胞，轉而攻擊臨近未感染細胞。Papapanou等［10］應用基因芯片分析了炎癥位點牙周組織的基因表達變化與11種牙周可疑致病菌檢出水平之間的相關關系，發現:8 537個芯片探針組相關基因的變化與牙齦卟啉單胞菌的侵入存在相關性。侵入細胞的Pg不僅能夠調控基因的表達，還可通過影響信號傳導通路和microRNA來控制細胞因子的表達和細胞凋亡。Mao等［11］的研究顯示:Pg感染牙齦上皮細胞可導致細胞內JAK1和STAT3的磷酸化，控制細胞內的線粒體細胞死亡途徑JAK/STAT通路，阻止宿主細胞的程序死亡，從而提高牙齦卟啉單胞菌在牙齦上皮細胞內生存。Moffatt等［12］發現:侵入牙齦上皮細胞的Pg可通過誘導microRNA－203來影響細胞因子信號3抑制子的表達。以上研究均提示:牙齦上皮細胞是Pg攻擊的主要靶目標，是牙周病變發生發展的始發部位之一。本研究選用KB細胞替代牙齦上皮細胞與Pg共孵育，模擬體內Pg感染宿主牙齦上皮的初始狀態。透射電鏡觀察顯示:Pg可成功侵入KB細胞，為后續分析Pg侵入上皮細胞后毒力基因的表達奠定實驗基礎。

同宿主真核細胞的相互接觸是誘導細菌特異性感染毒力因子表達的重要調控信號。Hendrickson等［13］的研究即顯示:Pg與牙齦上皮細胞共培養后可特異性上調表達396條蛋白。Rodrigues等［14］也發現:Pg侵入冠狀動脈內皮細胞后出現了62條編碼能量代謝轉移調控、細胞壁信封結構、核酸及蛋白修飾加工等蛋白的基因表達變化。以上結果均提示:Pg粘附和侵入上皮細胞后可能表達某些特異性毒力成分，從而干擾細胞正常結構和生理功能。基因的差異性表達是細菌、細胞形態和功能變化的根本原因，也是各種生理及病理過程發生的物質基礎。從全基因組角度研究Pg粘附和侵入宿主上皮細胞過程中細菌基因表達譜的變化，對于宏觀揭示Pg特異性致病機制具有重要意義。目前Pg W83和Pg ATCC 33277全基因組測序和部分基因功能鑒定已成功完成，為深入分析Pg差異表達基因的功能提供了依據。Tachibana等［15］已運用減雜交技術比較了純培養狀態下Pg ATCC 33277和Pg W83的差異表達基因，發現Pg W83具有5個不同于ATCC 33277的特異性毒力相關基因。本研究應用差異顯示反轉錄技術(DDRT－PCR)從全基因組分析純培養狀態和侵入KB細胞后的Pg ATCC 33277的基因表達差異，通過3個錨定引物和4個M13隨機引物的隨機組合擴增cDNA后，成功獲得3條差異基因條帶。其基因序列編號為:PGHX 01、PGHX 02、PGHX 03。進行測序和BLAST同源性比對分析，結果顯示:PGHX 01與Pg 33277的PG 0683基因序列有96%同源性。PGHX 02與Pg 33277的Pg 0159基因序列有97%同源性。PGHX 03未發現類似同源性基因序列。PGHX 01基因序列與編碼 ABC轉運蛋白(ATP－binding cassette transporters)基因序列 PG 0683［16－19］具有較高的同源性。ABC轉運蛋白是一種高度保守性的跨膜蛋白，廣泛存在于各個物種中。ABC轉運蛋白與腫瘤耐藥、囊腫性纖維化、高密度脂蛋白缺乏癥等相關;并與微生物生物膜形成、粘附功能、細菌耐藥性等存在相關性。Pg W83基因組中共有39個不同基因ABC轉座子已被確定［20］。研究顯示:ABC轉運蛋白參與了Pg血紅素的轉運、結合與吸收;敲除某些編碼ABC轉運蛋白的基因可影響Pg生物膜的形成、對宿主細胞的侵入、并參與調控LPS和細菌分泌系統的合成。本研究中，與ABC轉運蛋白編碼基因PG 0683高度同源性的PGHX 01基因出現表達，再次證實ABC轉運蛋白在Pg感染牙齦上皮細胞的過程中發揮重要的毒力作用。PGHX 02基因序列與編碼Pg PepO基因序列PG 0159高度同源。Pg PepO為一種基質金屬蛋白酶，與人內皮素轉換酶(ECE)－1有顯著同源性，人內皮素轉換酶－1可以轉換大內皮素 －1到內皮素 －1［21］。內皮素 －1水平升高，與動脈粥樣硬化和心臟衰竭的發病有關。在Pg中出現PepO部分揭示了牙周炎與動脈粥樣硬化相關性的微生物學機制［22－23］。Ansai等［24］研究發現缺乏Pep0基因的細菌變異型缺乏內肽酶活性，其對上皮的侵入效能僅為野生型的四分之一，提示Pep0在侵入細胞和細胞膜的溶解過程中發揮了一定作用。本研究所得PGHX 03基因經BLAST同源性比對，未發現類似基因。其可能為一種未知基因，編碼未知功能蛋白，目前尚無報道，有待于進一步的研究。

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