大蒜素對人牙周膜成纖維細胞的生物學作用

吳 更，徐宏志，李陽飛，謝曉莉，羅小良，張 宇，謝 靜，唐國旗

(1.市第一人民醫(yī)院口腔科，江蘇連云港222002;2.中南大學湘雅醫(yī)院口腔科，湖南長沙410008)

大蒜素(Garlicin、Allimin、Allicin)，又名大蒜新素(Allitride)，是大蒜球莖中分離出的一種化合物。具有抗腫瘤、抗微生物、抗?jié)儭⑻岣邫C體免疫力等多種藥理作用［1-3］。國內(nèi)外學者對大蒜的化學、藥理和臨床進行了多方面的研究，證明大蒜素殺菌力強，抗菌譜廣。

有研究發(fā)現(xiàn):大蒜素對根尖周病具有一定的治療效果［4］，并且有明顯的抑制糞腸球菌以及降低根管內(nèi)毒素的作用［5-8］;提示大蒜素有可能成為理想的根管消毒藥物，但其是否對根尖周組織有一定的毒副作用尚鮮有報道。本研究通過觀察大蒜素對人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament cells，HPDLCs)的增殖和總蛋白量的影響，為大蒜素作為根管消毒藥物用于臨床提供實驗室根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器(表1)

表1 主要試劑和儀器的來源

1.2 方法

1.2.1 HPDLCs的培養(yǎng)

取12～20歲志愿者因正畸減數(shù)拔除的前磨牙，用含雙抗(青霉素和鏈霉素)的PBS沖洗根面15～20遍，刮取根中1/3的牙周膜組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，平鋪于50 mL培養(yǎng)瓶底，加入5 mL含200 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，倒置于37℃ CO2孵箱內(nèi)孵育。待細胞生長達80%匯合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代細胞，并經(jīng)免疫鑒定，抗波形絲蛋白陽性;抗角蛋白陰性，表明系來自中胚層結(jié)締組織成纖維細胞。

1.2.2 大蒜素對HPDLCs增殖的影響

取生長良好的第5代HPDLCs以2×104/mL細胞密度接種于96孔板，加入含50 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，置CO2孵箱中，37℃培養(yǎng)。24 h后，棄原培養(yǎng)液，并將細胞隨機分為7組:1個空白對照組和6個實驗組，每組復6孔，6個實驗組分別加入含50 mL/L FBS、大蒜素終末濃度分別為10-2、10-1、100、101、102、103mg/L的DMEM培養(yǎng)液;空白對照組僅加含50 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，每孔100 μL。同時設置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，分別置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，每孔加入 5 mg/mL MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜液，低速振蕩10 min，酶標儀測各孔570 nm處的光密度(OD值)，并計算細胞抑制率。

1.2.3 大蒜素對HPDLCs總蛋白含量的影響

取生長良好的第5代HPDLCs，按上述1.2.2的方法進行分組處理，培養(yǎng)2 d后，棄去各組孔內(nèi)液體，用pH 7.4的PBS沖洗3次，吸干后在每孔加入100 μL 2 g/L Triton-100，振蕩30 min后，每孔各取20 μL分別與200 μL考馬斯亮藍染液混合，振蕩10 min，用酶標儀測各孔595 nm處的OD值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 原代細胞的生長狀況

組織塊法培養(yǎng)5～10 d，在倒置顯微鏡下可見組織塊周圍有細胞呈放射狀或偽足狀游出，以組織塊為中心，形成生長暈。細胞呈長梭形，有明顯的細胞分叉，胞核橢圓，居中，胞仁2～3個，胞漿豐富，細胞貼壁生長(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下原代HPDLCs(×10)

2.2 不同濃度大蒜素對HPDLCs增殖的影響(圖2)

不同濃度的大蒜素作用于HPDLCs后，細胞的生長均有不同程度的抑制。10-2～1 mg/L濃度范圍內(nèi)抑制作用不明顯;10 mg/L時對HPDLCs即有明顯的抑制作用，且隨濃度增加抑制作用越來越強，103mg/L時抑制率達81%。大蒜素對HPDLCs的半數(shù)抑制率約為22 mg/L。

圖2 大蒜素對HPDLCs增殖的影響

2.3 大蒜素對HPDLCs總蛋白含量的影響(表2)

表2 大蒜素對HPDLCs總蛋白含量的影響(±s)

表2 大蒜素對HPDLCs總蛋白含量的影響(±s)

不同字母組間P＜0.05

組別 總蛋白含量(OD值)對照組 0.718±0.003a 10-2mg/L 0.690±0.005a 10-1mg/L 0.619±0.002a 100mg/L 0.585±0.007a 101mg/L 0.366±0.005b 102mg/L 0.200±0.006c 103mg/L 0.108±0.004d

經(jīng)單因素方差分析，不同水平的大蒜素組HPDLCs總體均數(shù)不全相等(P＜0.05);SNK檢驗多樣本雙重比較，任意兩樣本均數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)。大蒜素在10～103mg/L各濃度組均能明顯抑制人牙周膜成纖維細胞總蛋白的合成，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而且隨濃度增高，其抑制作用越來越強，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但當大蒜素濃度低于10 mg/L時，抑制作用不明顯，10～10-2mg/mL各組組間相比，各組分別與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，從總體趨勢看，大蒜素濃度在103～10-2mg/L范圍內(nèi)，對牙周膜成纖維細胞總蛋白合成的影響呈依賴性。

3 討論

根管感染是以厭氧菌為主的多種細菌的混合感染，尤其是專性厭氧菌，是感染根管內(nèi)的優(yōu)勢菌。根管內(nèi)厭氧菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素［9］、各種毒性酶和菌體表面物質(zhì)以及一些可溶性的分解代謝產(chǎn)物，不僅能直接損傷根尖周組織，同時還可以作為抗原物質(zhì)，造成免疫性病理損害。近年來根管消毒方法的研究已經(jīng)取得了很大的進展，但是，在常規(guī)消毒藥物的應用上，仍缺少針對性，而且其毒副作也難以控制。因而尋找理想的根管消毒藥物，對提高根尖周病的治療效果具有重要意義。

大蒜素又名大蒜新素(Allitride)，是大蒜球莖中分離出的一種化合物，具有抗腫瘤、抗微生物、抗?jié)儭⑻岣邫C體免疫力等多種藥理作用［1-3］，且殺菌力強，抗菌譜廣，不良反應少。謝曉莉等報道:大蒜素對根尖周病具有較好的治療效果，尤其在治療難治性根尖周炎方面，療效更加顯著［4］。體外研究證明:大蒜素對糞腸球菌有明顯的抑制作用［5］;能有效抑制IL-6的產(chǎn)生，降低感染根管內(nèi)內(nèi)毒素濃度［6-8］。

MTT法測定細胞增殖，是基于黃色的MTT能被活細胞線粒體脫氫酶還原成藍色的formazan結(jié)晶，從而可用比色法推測細胞濃度。Mosmann［10］(1983)建立MTT比色法以來，已成為細胞生物學及相關研究領域一種分析細胞活性、生長增殖的常用方法［11］。本研究應用MTT法檢測不同濃度大蒜素對HPDLCs增殖的影響，結(jié)果顯示:大蒜素濃度在10 mg/L以上時能明顯抑制HPDLCs的增殖，抑制作用隨著濃度增加而增強，在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。

HPDLCs是牙周膜中最常見的細胞，是根尖周結(jié)締組織再生修復的細胞基礎。其主要功能是合成膠原，同時具有吞噬膠原并經(jīng)酶的水解而降解陳舊膠原的能力，因而合成和分泌蛋白是牙周膜成纖維細胞的重要功能指標之一。HPDLCs通過合成結(jié)構性和功能性蛋白完成細胞分裂、趨化、分化和細胞外基質(zhì)等一系列細胞活動［12］。本研究通過測定細胞總蛋白，發(fā)現(xiàn)大蒜素濃度在10～103mg/L時，能明顯抑制HPDLCs總蛋白的合成，與對照組比較有顯著性差異;而10-2～1 mg/L抑制作用不明顯。Masha等［13］研究證實大蒜素通過阻止微管蛋白單體聚合，激發(fā)微管解聚，干擾紡錘絲的形成，從而抑制細胞分裂、增殖，誘導其凋亡。破壞微管會抑制細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸，紡錘體是一種微管構成的動態(tài)結(jié)構，其作用是在分裂細胞中牽引染色體到達分裂極，因而微管與細胞分裂、增殖密切相關［14］。根據(jù)本結(jié)果，可以推測大蒜素在一定濃度下，通過某些分子機制，破壞HPDLCs的形態(tài)，甚至誘導其發(fā)生凋亡。

本研究結(jié)果與國內(nèi)外相關研究結(jié)果類似:大蒜素能抑制正常細胞的增殖和蛋白的合成，但稍有差異，本研究≤1 mg/L大蒜素組對HPDLCs無明顯抑制作用，而相關報道其安全濃度≤10 mg/L。分析原因可能:①靶細胞不同，本研究以HPDLCs為靶細胞，相關研究多以血管內(nèi)皮細胞、鼠胚成纖維細胞、人胚肺成纖維細胞等為靶細胞，不同細胞系細胞有不同的生長和增殖特點，耐受外來刺激的能力不同;②大蒜素純度不一，相關研究多從大蒜球莖中提取大蒜素，本研究大蒜素從醫(yī)藥公司購得成品，大蒜素純度和提取工藝差別甚大，其藥理作用可能會有差別。

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