牙齦卟啉單胞菌對人臍靜脈血管內皮細胞cGMP生成的影響

吳 娟，林良緣，孫衛斌

(1.南京大學口腔醫學院，南京大學醫學院附屬口腔醫院牙周科，江蘇南京210008; 2.福建醫科大學附屬泉州市第一醫院口腔科，福建泉州362000)

牙周病與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)的關系日益受到醫學界的重視，現有的流行病學、分子生物學、動物模型和體外實驗研究均表明:牙周病與As存在一定的相關性［1］。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是成人牙周炎的主要病原體［2］，目前的研究認為Pg感染是As發生、發展的重要危險因素［3］。Li等［4］研究表明:在ApoE(－/－)小鼠中，Pg能夠促進其As的發生，增強冠狀動脈粥樣斑塊的形成和鈣化;但牙周病在As發生、發展過程中的作用機制和作用環節，特別是對內皮細胞一氧化氮(nitric oxide，NO)信號通路中的意義報道尚少。

Liuba［5］研究認為:病原微生物的侵襲可造成血管內皮細胞損傷并損害血管NO信號通路，由此引起的血管內皮細胞功能障礙是As發生的起始環節。NO是由內皮細胞分泌的一種最重要的血管舒張因子，主要以L－精氨酸和分子氧為底物，經NO合成酶催化而合成。NO可以激活鳥甘酸環化酶(Guanylate，GC)，分解三磷酸鳥苷酸使細胞內cGMP水平升高，后者作為第二信使而促進血管舒張［6］。cGMP為檢測NO生物利用度的間接指標。

感染復數［7］(multiplicity of infection，MOI)是指感染時噬菌體與細菌的數量比值，即平均每個細菌感染噬菌體的數量，后來MOI被普遍用于病毒感染細胞的研究中，其含義是感染病毒與細胞數量的比值，本研究中的MOI是指感染Pg與臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)數量的比值［8］。本研究分別用MOI 1∶10、1∶50、1∶250的Pg ATCC 33277干預HUVEC，通過125I–cGMP放射免疫試劑盒檢測HUVEC cGMP的水平，以探討Pg對內皮細胞功能損傷的途徑。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

人臍靜脈內皮細胞株(HUVEC，ATCC，Manassas，VA，南京軍區南京總醫院外科研究所提供，來源于美國ATCC細胞庫);Pg ATCC 33277(四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供);DMEM培養基、新生牛血清、青霉素、鏈霉素(Gibco公司，美國);胰蛋白大豆肉湯、酵母、哥倫比亞瓊脂基質(OXOID公司，英國);125I－cGMP放射免疫試劑盒(上海中醫藥大學核醫學科研究中心);CO2孵箱(Heraeus公司，德國);厭氧罐(N2∶CO2∶H2= 80∶10∶10，BD公司，美國);IX70倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細胞系的維持培養

參照文獻［9］的方法，取HUVEC細胞株解凍復蘇后，分別加入含100 mL/L的熱滅活新生牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10 mmol/L Hepes的DMEM培養液，制成細胞懸液并接種于5個培養瓶中，置37℃50 mL/L CO2孵箱中貼壁培養，待細胞生長至80%融合后，用2.5 g/L胰蛋白酶和 0.1 g/L EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)進行消化傳代。

1.2.2 Pg ATCC 33277的培養和菌懸液制備

取Pg ATCC 33277常規復蘇后，接種于含酵母浸膏 1 g/L、氯化血紅素 50 mg/L、維生素 K310 mg/L、胰蛋白大豆肉湯30 g/L的培養基中，置厭氧罐(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10)中37℃培養。經哥倫比亞血瓊脂板檢測為Pg純培養后，取對數生長期的Pg ATCC 33277用不含青霉素、鏈霉素的DMEM制備細菌濃度分別為 1×109CFU/L、5×109CFU/L、2.5×1010CFU/L的菌懸液備用。

1.2.3 實驗分組和Pg ATCC 33277干預HUVEC

取生長良好的第5代HUVEC，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.1 g/L EDTA進行消化，DMEM培養液重懸，調細胞濃度為1×108/L后接種于6孔板中(每孔1 mL)，CO2孵箱中37℃培養。待細胞貼壁成單層后棄原液，PBS洗3遍，將細胞隨機分為4組(1個陰性對照組和3個實驗組)，每組復3孔，然后陰性對照組加入DMEM培養液;3個實驗組分別加入細菌濃度為 1×109、5×109、2.5× 1010CFU/L的Pg ATCC 33277細菌懸液(即 MOI 1∶10、1∶50、1∶250)分別繼續培養。

1.2.4 各組細胞形態觀察和cGMP水平檢測

分別于上述干預培養4、12和36 h細胞，用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態后，在每孔加入50 mmol/L的磷酸二酯酶抑制劑 10 μL，37℃50 mL/L CO2孵育5 min，棄上清，TBS沖洗2遍，加入0.3 mmol/L高氯酸1 mL，4℃下用細胞刮刮取并收集細胞，反復凍融破膜，3 000 r/min 4℃離心15 min，取上清。按125I－cGMP放射免疫試劑盒操作說明測定細胞中的cGMP濃度，由γ計數器預先編制的程序直接給出最大結合數(B0)和樣本讀數(B)，結果以B/B0(%)表示并繪制標準曲線，由曲線得出相應樣品cGMP濃度。以上實驗均重復3次。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 Pg ATCC 33277在血平板上純培養的情況

Pg ATCC 33277在哥倫比亞血平板上培養5 d后形成直徑約2 mm，凸起，有光澤，表面光滑的黑色球形菌落(圖1)，未見其他形態的菌落，可確定為純培養。

2.2 HUVEC的細胞形態學觀察

培養36 h后，對照組HUVEC細胞形態呈圓形，多角形或不規則形，均勻透亮，貼壁后呈典型的“鋪路石”狀鑲嵌排列，卵圓形細胞核居中，胞膜明顯，細胞彼此之間不重疊(圖2a)。與對照組相比，Pg ATCC 33277 MOI 1∶10、1∶50、1∶250干預36 h內，各組HUVEC細胞形態未見明顯改變，仍呈“鋪路石”狀貼壁生長，并未出現明顯的細胞收縮、變圓和脫離等(圖2b、c、d)。

圖1 Pg ATCC 33277在哥倫比亞血平板形成的菌落

圖2 36 h時各組HUVEC在倒置顯微鏡下細胞形態(×100)

2.3 Pg ATCC 33277干預對HUVEC細胞cGMP的影響(表1)

表1 Pg ATCC 33277對HUVEC細胞cGMP生成的影響 (pmol/mL，±s)

表1 Pg ATCC 33277對HUVEC細胞cGMP生成的影響 (pmol/mL，±s)

大寫字母為同一時間點內不同組間相比，小寫字母為同一組內不同時間點相比，不同字母組間P＜0.05

組別 干預培養時間4 h 12 h 36 h對照組 0.787±0.283Aa 1.282±0.325Aa 1.501±0.168Aa MOI 1∶10 0.782±0.151Aa 0.655±0.061Bab 0.551±0.123Bb MOI 1∶50 0.766±0.068Aa 0.742±0.136Ba 0.574±0.098Bb MOI 1∶250 0.770±0.058Aa 0.639±0.116Bb 0.498±0.136Bc

cGMP為檢測NO生物利用度的間接指標，本研究用Pg ATCC 33277以不同MOI干預HUVEC不同時間后，各組cGMP的水平不同。同一時間內各組相比，4 h時各組間均無差異(P＞0.05);而12 h和36 h時，各實驗組cGMP濃度均明顯低于對照組(P＜0.05)，但各實驗組之間無統計學差異(P＞0.05)。同一組內不同干預時間相比，對照組各時間無統計學差異(P＞0.05);MOI 1∶10和1∶50兩組4 h與12 h相比無統計學差異(P＞0.05)，且均以36 h時最低，與各組4 h、12 h相比差異有統計學意義(P＜0.05);MOI 1∶250組隨干預時間延長cGMP濃度逐漸下降，各時間點之間差異均有統計學意義(P＜0.05)，呈時間依賴性。

3 討論

牙周病是一種慢性感染性疾病，可導致牙齒周圍結締組織破壞、牙槽骨吸收，最終導致牙松動［10］。Pg是成人牙周炎的主要病原體，為G－無芽孢厭氧桿菌，主要定植于牙周袋上皮和齦下菌斑表面。有研究發現:Pg可粘附或入侵牙齦上皮細胞，在細胞內大量繁殖，釋放毒素，從而逃避宿主的防御機制［11］。Pg感染可導致局部炎癥反應，牙齦潰瘍形成以及局部微血管改變，從而增加暫時性菌血癥的發生率和嚴重性［12］。拔牙、牙周手術、潔治、刮治、刷牙、甚至咀嚼都可能促進Pg進入血循環，血管內皮細胞則成為Pg最初的靶細胞［13］。

慢性感染是動脈粥樣硬化的重要發病機理，可以通過直接損傷血管或誘導系統性炎癥反應，導致內皮細胞功能障礙，而內皮細胞功能障礙則是As發病的始動環節［14］。正常動脈壁的內膜是由單層內皮細胞所組成，內皮層是血液和組織之間的重要屏障，并參與機體的凝血、物質轉運和生物活性物質釋放等重要生命活動，且對細菌、細胞因子和LPS等各種刺激因子非常敏感，在機體炎癥和免疫應答中有著非常重要的作用［15］。NO是一種自由基性質的氣體，是內皮細胞分泌的一種最重要的血管舒張因子。NO可激活血管平滑肌細胞可溶性鳥苷酸環化酶，生成環磷酸鳥苷酸，繼而激活環磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶(PKG)，PKG可通過降低細胞內鈣離子敏感性或其濃度促進血管舒張;另外，NO還可以抑制血小板聚集，抑制白細胞粘附、平滑肌細胞增殖和遷移，減少氧自由基產生和低密度脂蛋白氧化等抗As的作用［6］。內皮組織感染可以引起NO生物利用度下降，Bouwman［16］通過體外研究證明:肺炎衣原體感染的血管內皮細胞eNOS功能下降，下調NO通路產物cGMP。因此研究Pg對HUVEC NO的影響可以為牙周病在As發病機理中的作用進一步提供實驗依據。

本研究發現，體外用Pg ATCC 33277分別以MOI 1∶10，1∶50，1∶250干預HUVEC 4、12、36 h后，HUVEC的細胞形態未見明顯改變，仍呈典型的“鋪路石”單層貼壁生長，但在MOI 1∶250時可時間依賴性地降低HUVEC cGMP的水平，而同一時間點，各個濃度組的cGMP水平并無明顯差異。

Roth［17］研究認為:Pg 381MOI 1∶10，1∶100干預人主動脈內皮細胞24 h時，對內皮細胞的形態無影響，對內皮細胞的存活無有害作用，而 Pg 381MOI 1∶500，1∶1 000則可以引起細胞收縮，變圓，細胞脫離，引起細胞凋亡。本研究同樣顯示Pg ATCC 33277 MOI 1∶10、1∶50、1∶250干預HUVEC 36 h時對細胞形態無有害作用。有研究發現Pg MOI 1∶100可以激活內皮細胞粘附分子的釋放［18］，例如細胞間粘附分子(ICAM－1)、血管細胞粘附分子(VCAM－1)、p－選擇素、E－選擇素等，從而有利于中性粒細胞向內皮細胞趨化，促進血管平滑肌細胞的遷移和增殖;促進血細胞的游走以及動脈粥樣硬化的形成。因此我們認為，在早期，低濃度的Pg對內皮細胞的形態無影響，但可以影響內皮細胞的功能，例如誘導內皮細胞粘附分子和炎癥細胞因子的表達［13］。

前期研究結果顯示［19］:Pg ATCC 33277 MOI 1∶10、1∶100可以抑制HUVEC內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)蛋白表達，誘導誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白表達，最終促進 HUVEC細胞NO的生成。有趣的是:本研究cGMP水平不僅沒有因為大量生成NO而增加，卻反而下降，表明NO的生物利用度下降，提示NO可能直接發揮組織和細胞毒性作用。

本結果顯示:Pg早期雖對HUVEC細胞形態無有害作用，但可降低HUVEC cGMP的生成，表明NO的生物利用度下降，提示Pg可能會導致血管內皮細胞功能障礙。然而在體內，NO分子是一種半衰期極短的生物活性分子，作為重要的細胞內和細胞間信號調節分子，其與cGMP的關系非常復雜，且并非直接1∶1的關系，因此還需要進一步的體內研究證實。

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