乳腺癌組織中EGF和ALDH1A1的表達及其臨床意義

毛 俊，張晴晴，李連宏，王 波，范姝君，于曉棠

(大連醫(yī)科大學(xué)中日臨床病理中心，遼寧大連116044)

2003年Al-Hajj等［1］利用體外致瘤實驗首次證實乳腺癌干細胞的存在，并確定其特異細胞表型為，其中的細胞亞群最低僅200個腫瘤細胞即可使NOD/SCID小鼠致瘤，并且從重建的乳腺癌組織中分離出的細胞還能再次在NOD/SCID鼠體內(nèi)重建出乳腺癌組織。2007年Ginestier等［2］研究發(fā)現(xiàn)只需要500個細胞表型乙醛脫氫酶(ALDH1A1)陽性的乳腺癌細胞即可在裸鼠體內(nèi)形成異質(zhì)瘤，其中細胞亞群僅20個就能形成乳腺腫瘤，為乳腺癌干細胞研究提供了新的標志物。多項研究表明，乳腺癌干細胞與乳腺癌的治療及預(yù)后密切相關(guān)，可能是化療失敗以及腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段和多基因改變的過程［3］。表皮生長因子(EGF)是一種重要的調(diào)控細胞生長的因子，可以保持干細胞持續(xù)增殖的狀態(tài)。我們通過檢查正常乳腺和乳腺癌組織中EGF和ALDH1A1的表達情況，探討EGF在乳腺癌干細胞發(fā)生發(fā)展中可能的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2008年1月～2011年7月收治的乳腺癌患者45例，其中組織學(xué)分型高中分化(Ⅰ～Ⅱ級)22例、低分化(Ⅲ級)23例，患者手術(shù)前均未接受任何治療，年齡31～62歲、平均47歲。正常乳腺組織取自同期24例乳腺增生患者，年齡42～65歲、平均52歲。手術(shù)標本采集后立即置入液氮冷凍，然后－80℃冰箱備用。所有診斷均經(jīng)病理檢查證實。

1.2 主要試劑 鼠抗人EGF單抗購置于Santa公司，兔抗人ALDH1A1購于Abcam公司，總RNA提取試劑TRIzol購于Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司。

1.3 細胞總RNA提取和RT-PCR 首先將凍存的組織勻漿，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。利用Prime5軟件設(shè)計并由大連寶生物公司合成引物。EGF上 游 引 物 為 5'-TATCATTCTGTTGCCAGTAGTTTC-3'，下游為 5'-AAGTTGTCTTTCTAAATCCACCC-3';ALDH1A1上游引物為5'-AATGGCATGATTCAGTGAGTGGC-3'，下游為 5'-GAGGAGTTTGCTCTGCTGGTTTG-3';內(nèi)參為β-actin，上游引物為5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'，下游為5'-CACCTTCACCGCTTCAGTTT-3'，產(chǎn)物大小為306 bp。紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度，然后按照 Reverse Transcription System試劑盒(KATARA)操作合成cDNA，進行PCR擴增。PCR條件為:95℃ 5 min、95℃30 s、51℃30 s、72℃30 s，30個循環(huán)，72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用QUANTITY ONE軟件分析電泳條帶與內(nèi)參的灰度值，以與內(nèi)參β-actin的比值代表EGF與ALDH1A1的相對表達量。

1.4 免疫組織化學(xué)方法檢測EGF與ALDH1A1蛋白的表達 乳腺組織標本于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后按4 μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精連續(xù)脫水。按SABC顯色試劑盒(北京中杉金橋)步驟操作，EGF與ALDH1A1一抗?jié)舛葹?∶100，DAB顯色，顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果判定標準為細胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒反應(yīng)為陽性。

1.5 染色結(jié)果判斷 陽性染色細胞呈淺棕色或棕黃色。EGF和ALDH1A1蛋白主要在胞質(zhì)中表達。采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)和IMAGE PRO-PLUS 5.0圖像分析軟件，對每張切片隨機選擇5個不重復(fù)的陽性反應(yīng)視野照相，計算平均光密度(aIOD)值，aIOD值與陽性區(qū)域的面積和著色深淺呈正比，即aIOD值越大，代表蛋白含量越高。依次記錄測量結(jié)果，aIOD≥0.5定性為陽性表達，aIOD＜0.5為陰性表達［4］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組均數(shù)比較用 t檢驗，非參數(shù)檢驗及Spearman作相關(guān)性分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果 正常乳腺組織、乳腺癌組織中EGF mRNA表達水平分別為0.57±0.02、1.14 ±0.21(P＜0.01)，ALDH1A1 mRNA表達水平分別為0.54±0.07、1.27±0.17(P＜0.01)，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測EGF和ALDH1A1的mRNA表達

2.2 免疫組化結(jié)果 EGF、ALDH1A1均為胞質(zhì)著色。24例正常乳腺組織中有5例(20.8%)EGF陽性，45例乳腺癌組織中有34例(75.6%)EGF陽性，兩組比較P＜0.01。24例正常乳腺組織中有4例(16.7%)ALDH1A1陽性，45例乳腺癌組織中有29例(64.4%)ALDH1A1陽性，兩組比較P＜0.01。見插頁Ⅰ圖1。

2.3 乳腺癌組織中EGF與ALDH1A1表達相關(guān)性在45例乳腺癌組織中有24例(53.3%)EGF、ALDH1A1均為陽性表達，相關(guān)分析顯示，EGF和ALDH1A1的表達呈正相關(guān)(r=0.302，P＜0.05)。

2.4 乳腺癌組織中EGF與ALDH1A1表達與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 EGF和ALDH1A1的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

EGF是1962年首次在小鼠的下頜下腺中發(fā)現(xiàn)的一種小分子蛋白，1975年從人尿中提出人EGF (hEGF)。EGF可以促進細胞有絲分裂及糖、蛋白質(zhì)、DNA及RNA合成，可通過傳導(dǎo)信號啟動與細胞分裂有關(guān)的基因，使靜止細胞進入細胞分裂期，從而使細胞增殖［5］。本實驗發(fā)現(xiàn)，EGF在乳腺癌組織中基因和蛋白的表達明顯高于正常乳腺組織，提示EGF對乳腺癌的發(fā)生起重要作用。

ALDH1是乙醛脫氫酶家族成員之一，是將細胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細胞溶質(zhì)酶，參與多種組織的分化與基因表達，同時也在正常干細胞與腫瘤干細胞生長和分化的中起重要作用［6，7］。研究表明，ALDH1在乳腺干細胞、造血干細胞以及神經(jīng)干細胞等細胞中高表達，ALDH1現(xiàn)已被認為是乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌、結(jié)直腸癌干細胞的通用標記物［2，8～11］，它是目前癌干細胞標記物研究熱點之一，特別是作為乳腺癌干細胞的標記物。2007年Ginestier等［2］首次利用ALDH1在乳腺癌實體組織中分選出乳腺癌干細胞，他們比較ALDH1+和ALDH1－細胞兩組細胞亞群的腫瘤形成實驗中發(fā)現(xiàn)，500個ALDH1+細胞就能形成腫瘤，而即使用50 000個 ALDH1－細胞也不會形成腫瘤，說明ALDH1+細胞具有很高的致瘤能力。當對臨床樣本進行免疫組化檢測時發(fā)現(xiàn)，ALDH1+乳腺癌干細胞與basa-like型以及HER2過表達型乳腺癌均相關(guān)，而basal-like型和HER2過表達型在乳腺癌所有基因亞型中存活期最短，預(yù)后最差［12］，所以ALDH1+乳腺癌患者預(yù)后較差。提示ALDH1是一種可應(yīng)用于檢測癌干細胞的重要標記物，而且用這種簡單的標記物可評估腫瘤患者預(yù)后。本實驗發(fā)現(xiàn)ALDH1A1在乳腺癌組織中基因和蛋白水平明顯高于正常乳腺組織，ALDH1A1蛋白的表達與乳腺癌組織學(xué)分型表達存在正相關(guān)，與年齡、腫瘤大小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及PR無明顯相關(guān)性。

目前研究認為，EGF作為一種重要的生長因子，許多因素都可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生，并通過不同的方式激活表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)途徑。多數(shù)EGFR具有酪氨酸激酶活性，并通過這一機制對干細胞進行調(diào)控。研究中發(fā)現(xiàn)［13］，EGF與EGFR結(jié)合后，活化有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子-3(STAT-3)將信號傳遞至細胞核，激活受體特異性酪氨酸激酶，導(dǎo)致自身和蛋白底物磷酸化，進而激活Na+/H+交換，并引起干細胞內(nèi)Ca2+濃度增高，致使干細胞DNA合成增加。體外實驗證實EGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞分裂增殖，加入EGF可使Brd2U標記的神經(jīng)前體細胞明顯增加。胚胎鼠的視網(wǎng)膜前體細胞在EGF作用下可分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞［14］。Ponti等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)基中添加EFG能顯著提高乳腺癌干細胞球的比例。在我們的研究中，乳腺癌組織中EGF與ALDH1A1的表達存在正相關(guān)，由此我們推測，EGF的過表達促進了乳腺癌干細胞的增殖。在隨著EGF在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機制進一步揭示，我們可以推斷EGF可能成為乳腺癌干細胞治療的一個靶點。

［1］Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumourigenic breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(7):3983-3988.

［2］Ginestier C，Hur MH，Charafe-Jauffret E，et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cell and a predictor of poor clinical outcome［J］.Cell Stem Cell，2007，1(5):485-487.

［3］Chute JP，Muramoto GG，Whitesides J，et al.Inhibition of aldehyde dehydrogenase and retinoid signaling induces the expansion of human hematopoietic stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(31):11707-11712.

［4］Gundersen HJ，Bagger P，Bendtse FT.The new sterological tools: disector，fractionators and point samples intercept and their use in pathological research and diagnosis［J］.APMIS，1988，96(10): 857-860.

［5］廖小金.表皮生長因子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)效應(yīng)［J］.海峽藥學(xué)，2006，5 (18):14-17.

［6］Pearce DJ，Taussig D，Simpson C，et al.Characterization of cells with a high aldehyde dehydrogenase activity from cord blood and acute myeloid leukemia samples［J］.Stem Cell，2005，23(6): 752-760.

［7］Hess DA，Wirthlin L，Craft TP，et al.Selection based on CD133and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long term reconstituting human hemat opoietic stem cells［J］.Blood，2006，107(5):2162-2169.

［8］Lugli A，Iezzi G，Hostettler I，et al.Prognostic impact of the expression of putative cancer stem cell markers CD133，CD166，CD44s，EpCAM，and ALDH1 in colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2010，103(3):382-390.

［9］Jiang F，Qiu Q，Khanaa A，et al.Aldehyde dehydrogenase1 is a tumor stem cell associated marker in lung cancer［J］.Mol Cancer Res，2009，7(3):330-338.

［10］Seigel GM，Campbell LM，Narayan M，et al.Cancer stem cell characteristics in retinoblastoma［J］.Mol Vis，2005，11:729-737.

［11］Huang H，Hynes MJ，Zhang T，et al.Aldehyde dehydrogenase1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells(SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis［J］.Cancer Res，2009，69(8):3382-3389.

［12］Naksh H，Soure F，Badve S.Breast cancer stem cells and intrinsic subtypes:controversies rageon［J］.Curr Stem Cell Res Ther，2009，4(1):50-60.

［13］王宏.表皮生長因子的研究進展［J］.國外醫(yī)學(xué):免疫學(xué)分冊，1995，18(3):146-148.

［14］Lillien L，Cepkc C.Control of proliferation in the retina:temporal changes in responsiveness to FGF and TGFa［J］.Development，1992，115(1):253-266.

［15］Ponti D，Costa A，Zaffaroni N，et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitorcell properties［J］.Cancer Res，2005，65(13):5506-5511.