肢體缺血動物模型研究進展

陳斌玲 ，焦雨歡 ，劉 雙 ，高 冬 *，宋 軍

1.福建中醫藥大學，福建 福州 350108；2.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700

當前缺血性疾病患者日漸增多，以糖尿病肢體動脈閉塞癥（DAO）、閉塞性動脈硬化癥（ASO）和血栓閉塞性脈管炎（TAO）為主的下肢缺血性疾病發病率逐年增加。國外資料顯示，70歲以上老年人群中僅動脈硬化閉塞癥患病率即可達15%～20%[1]。而患病人群范圍可覆蓋至青壯年，其高發生率和廣泛累及率已嚴重危害著人們的身心健康和生存質量，亟待探索其發生機制、預防措施及治療方法。建立缺血動物模型是開展缺血性疾病研究的一種有效途徑。通過對動物模型的在體研究，有助于闡明缺血性疾病的病變機制、發展過程，篩選出有特異性治療作用的藥物及方法。近年來，通過建立動物后肢缺血模型進行血管新生、基因療法和干細胞移植等研究已成為現代生物醫學領域中的研究熱點。綜合國內外研究資料可見，肢體缺血模型適用于急性缺血、慢性持續性缺血、肢體缺血再灌注以及缺血預處理等幾方面的研究[2-10]。因此，如何根據實驗目的正確選擇肢體缺血模型的制作方法，以及如何對該模型的缺血效果進行評價，從而制作出效果確實可靠、穩定性良好的肢體缺血模型顯得尤為重要。有學者根據缺血效果將缺血動物模型總結為暫時缺血和永久缺血兩大類[2]，本研究現對這兩類肢體缺血模型的建立、應用和評價作一總結，以期為該模型的相關研究應用提供參考。

1 模型制作

1.1 暫時缺血模型

暫時缺血模型包括肢體缺血再灌注損傷模型[3]以及缺血預處理模型，適用于肢體缺血再灌注損傷的防治[4]、肢體遠距缺血預處理[5]和肢體遠距缺血后適應[6]的研究。暫時缺血模型制作方法分為肢體環扎法和暫時阻斷動脈法兩種。肢體環扎法是外用繃帶、止血帶或橡皮筋等物質環扎于動物單側或雙側肢體根部[4，7]，一段時間后放開，以此達到暫時缺血的目的。環扎時間視研究目的而異，缺血再灌注損傷一般為4 h左右，而肢體缺血后適應或肢體遠距預處理多為5 min，并反復多次進行。肢體環扎法具有無創性，對實驗動物的損傷較小。暫時阻斷動脈法通過手術分離實驗動物某側局部供血動脈，用血管夾暫時夾閉血流，最少3 h后撤夾恢復血流灌注，其效果比肢體環扎法可靠，但對實驗動物的損傷較大[8]。Messina等[2]將兩種方法相結合使用，以加強肢體的急性缺血程度，其效果較單純環扎或單純夾閉血管要好。大體上看，暫時缺血模型的建立方法簡便、易行，效果能夠令人滿意，基本上可以符合實驗要求。

1.2 永久缺血模型

永久缺血模型是目前國內外肢體急、慢性缺血模型的主流，在缺血損傷、血管新生、細胞移植及基因轉染等方面研究應用最為廣泛[9-11]，其制作方法繁多，主要有血管結扎切斷法和血管栓塞法等。

1.2.1 血管結扎切斷法 血管結扎切斷法在暫時阻斷動脈法基礎上，將分離出的某支供血動、靜脈主干或其分支進行結扎或切斷以造成急性血管永久阻斷從而引起缺血，為國內外肢體缺血模型中最常用的制作方法。根據阻斷方式和阻斷血管的不同又可細分為單純結扎血管、結扎并切斷血管、動靜脈雙阻斷和單純動脈阻斷幾種類型。單純結扎血管法主要用于構建缺血時間不超過2周的急性缺血模型。而結扎并切斷血管法比單純結扎血管所產生的缺血現象嚴重，缺血時間長達4周左右，甚至Luo等[12]通過2次手術造成實驗動物更為嚴重的缺血，持久時間約60 d，適用于慢性持續性肢體缺血模型的建立。動靜脈雙結扎切斷雖可造成較嚴重的缺血損傷，但其引起的病理改變與外周動脈疾病存在較大差異[13]，目前主要用于缺血模型影響因素方面的研究。而單純動脈結扎切斷因其所引起的血流變化與臨床外周動脈疾病相似而被廣泛應用[13]，備選切斷的血管有股動脈[14]、股動脈及其分支[15]、髂總動脈[16]以及髂、股動脈及其分支[17-18]等，所引起的缺血損傷程度大體上依該次序遞增。不同學者因采用的實驗動物品種不同，選擇結扎切斷的動脈也不盡相同，單純切斷股動脈或髂總動脈一般用于下肢血管非常細的大鼠等小型動物；結扎切斷髂股段動脈及其分支，可用于犬、兔等大型動物及小鼠、大鼠等小型動物的造模[18-20]。若實驗動物下肢血管豐富，如小鼠解剖上雖然缺乏股深動脈，但髂股段存在大量側支血管，則需同時切斷髂股段的主要分支以防止側支血流的快速重建[20]。以此類推，結扎并切斷髂股段動脈及其分支為最普遍采用的永久缺血模型造模方法。

1.2.2 血管栓塞法 血管栓塞法采用外周性血管栓塞劑注入實驗動物下肢供血動脈引起血管栓塞進而產生缺血。不同栓塞劑栓塞效果不一。碘化油和明膠海綿屬于短期血管栓塞劑，不僅無法栓塞微血管網，且Kobayshi等[21]報道稱，增加栓塞次數，會導致組織缺氧引起血管內皮生長因子（VEGF）及Bcl-2蛋白過量表達，加速形成側支循環而降低栓塞效果，缺血持續時間約1周，無法滿足慢性缺血的特性。而白及膠因其直徑小至3.5mm，可栓塞末梢小動脈，維持時間長達5周，隨后被降解吸收，可允許重復栓塞治療。而且堵塞在較大口徑血管內的白及膠在血流的沖擊和溶解下，產生“遷徙”現象，到達更細的分支內造成更均勻、徹底的栓塞，同時，白及可抑制革蘭陽性菌而減少被栓塞器官的感染[22]。為進一步提高栓塞效果，可將白及膠進行乳化、凍凝、化學交聯后制備出白及膠微球，其不僅具有白及膠的特性，還能在血液中緩慢膨脹機械性阻塞血管，粗糙的表面可促使血小板解體，導致繼發性血栓形成，并可持續至少一個月不被溶解。因白及膠微球直徑僅為幾十微米，能更均勻、徹底地栓塞后肢小血管分支，達到完全性栓塞的效果，栓塞作用時間持久，效果穩定，重復性好，是一種理想的肢體缺血模型制作方法[23]。目前國內學者多將其應用于大鼠慢性肢體缺血模型的制作，國外還未見相關報道。

1.2.3 其他方法 采用不同手段使動脈管腔縮窄或閉塞，適用于犬、兔等大型動物造模。馬中等[24]、邊杰芳等[25]通過結扎包括股深動脈在內的所有分支，縱形切開股動脈前壁0.5 cm，自切開處向動脈腔遠端并列插入2根長25～30 cm，直徑1.5 mm的螺旋狀金屬絲，插入后以無創血管縫線縫合動脈切口，并使股動脈管腔縮窄約1/2，逐層縫合皮下組織及皮膚的方法制作犬后肢缺血模型。其原理是通過置入的異物使血管內皮受損，膠原成分暴露，激活外源性凝血機制，逐漸形成管腔內血栓；同時金屬絲的機械栓堵人為將股動脈管腔縮窄約1/2，迫使動脈血流銳減，側支代償相對不足，而造成顯著的肢體慢性缺血癥狀。Grigorios等[26]通過將3-F導管插入新西蘭大白兔左股淺動脈，并置入5個鉑金線圈的方法使動物血管閉塞，成功制作肢體缺血模型。另外，Gale等[27]報道一種含有吸濕性酪蛋白的縮窄器，可吸收血管腔內水分并逐漸膨脹，進而阻塞整個血管腔，亦可用于制作慢性下肢缺血動物模型。

2 模型評價

2.1 暫時缺血模型

骨骼肌缺血損傷是一個多因素參與的復雜過程，目前主要圍繞下述幾方面機制的指標對模型進行相應評估：①能量代謝障礙。當組織缺血時，有氧代謝途徑受阻而變為無氧代謝，乳酸、乳酸鹽大量增加對細胞造成損害，細胞膜完整性破壞，細胞內酶及蛋白質外漏，而致血中肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶的含量明顯升高[4]。②氧自由基損傷。肢體缺血或再灌注時，肌體產生大量氧自由基使組織內過多消耗超氧化物歧化酶（SOD），同時不飽和脂肪酸發生脂質過氧化形成丙二醛（MDA）不斷損傷組織，并引起鈣超載，進一步加重組織的損傷，故血清和骨骼肌SOD、MDA含量可反映組織氧自由基含量及氧化損傷程度[4]。③骨骼肌鈣離子超載和黃嘌呤氧化酶（XOD）[28]水平。骨骼肌缺血和再灌注后不斷產生的氧自由基損傷了細胞膜和線粒體膜，使Ca2+-ATP酶活性不斷降低，不能將胞內的Ca2+泵出胞外，導致細胞內的Ca2+濃度明顯增加；同時，再灌注時鈣離子交換受阻，線粒體及溶酶體內Ca2+濃度升高，Ca2+與胞漿受體鈣調蛋白結合后，激活蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶轉變為XOD而大量堆積。④炎癥反應。血清髓過氧化物酶（MPO）是中性粒細胞的標志酶，可反映中性粒細胞聚積的程度，下肢腓腸肌病理學檢測可觀察中性粒細胞的浸潤情況[4]，通過檢測MPO含量及骨骼肌病理學觀察以明確炎癥反應的程度。⑤血管內皮損傷。其可通過腓腸肌濕重干重比測定[4]和病理學觀察加以確定。前者反映骨骼肌組織水腫程度，與再灌注損傷時組織微血管床損傷有關；后者可直觀形象地反映肢體骨骼肌微血管內皮細胞損傷情況。此外，結合機體骨骼肌缺血損傷的臨床綜合表現，還需進行肢體顏色、皮溫、活動狀態等一般狀態觀察[16]。

2.2 永久缺血模型

要想建立與嚴重慢性肢體缺血患者具有相似性的動物模型，必須利用現有的技術手段，其中，微血管密度為判斷側支循環生成的“金標準”[29]，血管造影和血流灌注測定是必備的監測方法，從而客觀、具體地評價缺血的程度和時間。國內外學者普遍以健側肢體作為對照，從形態和功能兩方面同時對下肢永久缺血模型進行評價[30]。①形態方面：通過各種血管造影等技術手段分析后肢側支血管數和微血管密度，最常用的血管造影術為動脈注射數字減影法[15]，但其空間分辨率不高，細小血管顯示欠清晰，可采用CT血管造影[30]更逼真地顯示血管立體形態及其與周圍結構關系。除此以外，還可結合病理形態學觀察缺血組織結構進行多方面評價模型缺血效果。②功能方面：采用功能等級評分表[31]（目前已形成的有鼠后肢缺血等級評分標準表[32]）結合動物缺血損傷的一般臨床表現對肢體功能進行評價，并使用激光多普勒灌注系統[17]測定下肢血流量、血壓和皮溫評價肢體血流灌注情況。近年越來越多的先進技術被應用于側支循環功能的評價，并各具特點，其中，放射性同位素灌注掃描簡便易行，能準確地定量、定位，但顯影所需時間較長[20]；CT灌注成像能快速、無創、定量或半定量地反映組織血管生成及血流灌注，較準確地評估動物后肢缺血模型隨時間推移發生的肌肉組織灌注變化，但存在運動偽影、溶劑效應等問題[29]；核磁共振成像不需注射造影劑，是一種非介入探測技術，但掃描時間長，空間分辨率不及CT，且價格較昂貴[26]。

3 問題及展望

鑒于肢體缺血動物模型的制備方法、實驗條件控制等方面都取得了很大進展，且CT、核磁共振成像等新技術在模型評價中的推廣應用，很大程度促進了肢體缺血模型的研究。但還有一些突出問題尚待解決，主要體現在永久缺血模型的穩定性和擬人性方面欠佳。由于實驗動物具有極強的血管重建能力，并且急性缺血后局部產生的剪切力、炎性反應、內皮祖細胞的局部浸入以及動物豐富的側支循環，使患肢能在短時間內促進血管新生，進而恢復血流。許多研究發現，即使結扎并切斷實驗動物后肢供血動脈，引起遠端肢體缺血壞死的情況并不持久[16，28]，且不同的造模方法導致的缺血程度和持續時間差異較大，使得模型的穩定性急待進一步提高。另外，雙側下肢缺血造模死亡率高[20]，導致實驗動物一般為單側造模，患肢由初期急性嚴重缺血可逐漸恢復到穩定的輕度缺血狀態，而人的下肢慢性缺血往往發生在雙側，是一個緩慢的逐漸加重的過程。因此，如何建立一個擬人性較好、可行性高、重復性好的動物慢性肢體缺血模型仍有待進一步探索研究。可喜的是已有學者開始對不同年齡[31]、不同品系[33]、不同性別[34]以及不同缺血效果[27]的動物模型特點進行比較研究，為關鍵問題的解決提供了基本條件。同時，隨著不同實驗方法的整合和各種新技術的發明應用，必將進一步推進肢體缺血模型制作體系的完善。

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