用HPLC法測定人血漿中美羅培南的濃度

陳曉晶，梁海濤，覃韋葦，李中東＊，徐一新

（1.上海健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)教研室，上海200237；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院藥劑科，上海200040）

美羅培南是一種具有廣譜抗菌活性的碳青霉烯類抗生素，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而產(chǎn)生抗菌作用。該藥常用于治療致病菌不明的感染，或者由單一或多種細(xì)菌引起的成人及兒童的各類重癥感染，例如復(fù)雜性腹腔感染、醫(yī)院獲得性肺炎、嚴(yán)重的社區(qū)獲得性肺炎、伴囊性纖維化癥的肺部感染、細(xì)菌性腦膜炎、敗血癥等［1］。雖然美羅培南中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）安全性好，神經(jīng)毒性低于亞胺培南／西司他汀鈉，但是腎功能受損的病人使用美羅培南，仍可能出現(xiàn)嚴(yán)重的CNS不良反應(yīng)。因此對于腎功能受損的病人，應(yīng)該根據(jù)不同病人的藥動(dòng)學(xué)特征減少美羅培南的劑量或延長給藥間隔［2］。

本研究旨在建立測定人血漿中美羅培南的HPLC－UV法，為其藥動(dòng)學(xué)研究和臨床血藥濃度監(jiān)測提供參考，促進(jìn)臨床合理、安全使用美羅培南。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 2487型雙波長紫外檢測器、Millennium 32色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Waters公司）；Sigma 3k－15型高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；Millivac小型真空泵（美國Millipore公司）；Bond Elut固相萃取小柱（C 2，100mg，1ml，美國Varian公司）；VacMaster－20型半自動(dòng)真空固相萃取裝置（美國VacMaster公司）；BP－211D十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品和試劑 美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品（純度87%，批號130506－200702）；氫氯噻嗪對照品（純度＞98%，批號100309－200702，中國食品藥品檢定研究院）。甲醇（色譜純，美國Promptar公司）；磷酸二氫鉀（分析純，汕頭金砂化工廠有限公司）；甲酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三乙胺（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；純化水由Milli－Q超純水器（美國Millipore公司）制備。空白血漿由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院血庫提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制 精密稱取美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水溶解并配制成濃度為1.00mg／ml的儲(chǔ)備液；用甲醇∶水（50∶50）稀釋此儲(chǔ)備液，配制成濃度為750、250、100、25、10、5μg／ml的美羅培南系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取內(nèi)標(biāo)氫氯噻嗪對照品適量，置10ml容量瓶中，用水溶解并配制成濃度為1.00mg／ml的儲(chǔ)備液；用甲醇∶水（50∶50）稀釋此儲(chǔ)備液，配制成濃度為500μg／ml的氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)工作溶液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血漿樣品預(yù)處理 Bond Elut固相萃取柱預(yù)先用1ml甲醇和1ml純化水依次處理。取200μl血漿樣品，加入50μl的氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻后過固相萃取柱，用0.5ml濃度為5mmol／L的磷酸二氫鉀溶液（pH 6）洗滌，真空抽濾至固相萃取柱床干燥，棄去濾液。然后用0.5ml甲醇－0.1%甲酸（15∶85）洗脫。洗脫液經(jīng)1.15×104×g離心5min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.3 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：5mmol／L磷酸二氫鉀溶液（pH 6）－甲醇（15∶85）；柱溫：40℃；流速：1ml／min；檢測波長：298nm；進(jìn)樣量：40μl；內(nèi)標(biāo)物：氫氯噻嗪。

2.4 方法專屬性 分別取6份不同來源的空白血漿200μl，制備不含美羅培南和氫氯噻嗪的空白血漿陰性對照，按2.2項(xiàng)下方法操作，即得。與含有美羅培南、氫氯噻嗪的血漿樣品比較，由圖1可見，美羅培南、氫氯噻嗪保留時(shí)間分別為7.2和6.1min，兩者分離良好，血中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測定。

圖1 人血漿中美羅培南和內(nèi)標(biāo)的HPLC譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 取空白血漿200μl，精密量取美羅培南系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，分別配制美羅培南濃度為75、25、10、2.5、1.0、0.5μg／ml的血漿樣品，按2.2項(xiàng)下方法處理，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析。以待測物色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，待測物濃度（X）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)（W＝1／x2）最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，回歸方程為Y＝0.123 1 X＋0.046 01，r＝0.998 0。美羅培南在0.5～75μg／ml內(nèi)的線性關(guān)系良好。定量下限可達(dá)0.5μg／ml。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取空白血漿200μl，精密量取美羅培南系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，分別配制美羅培南濃度為40、10、1.5μg／ml 3種不同濃度的血漿樣品，按2.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行色譜分析，在一個(gè)分析批內(nèi)測定6次，計(jì)算批內(nèi)精密度。在不同日連續(xù)制備并測定3個(gè)分析批次，計(jì)算批間精密度。計(jì)算得到批間精密度RSD＜12.7%（n＝3），批內(nèi)精密度RSD＜11.4%（n＝6）。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 取空白血漿200μl，按2.1項(xiàng)下方法分別制備低、中、高濃度（美羅培南濃度分別為1.5、10、40μg／ml）血漿樣品，按2.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，每一濃度進(jìn)行6樣本分析。同時(shí)用流動(dòng)相配制相同濃度的美羅培南和氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)混合溶液。分別進(jìn)樣分析，以每一濃度兩種處理方法的峰面積的比值計(jì)算回收率。結(jié)果表明，低、中、高濃度美羅培南的回收率分別為（90.5±8.7）%、（86.8±8.4）%和（91.7±7.9）%（n＝6）。

2.8 穩(wěn)定性考察 測定血漿樣品在室溫放置2h、－70℃冰箱放置10d、－20℃冰箱反復(fù)凍融3次，以及樣品處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)4℃放置12h的穩(wěn)定性，每一種濃度平行操作3次。結(jié)果見表1。由表1可見，樣品在考察的放置條件下穩(wěn)定。

表1 血漿中美羅培南在不同條件下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝3，ρB／μg·ml－1）

3 討 論

文獻(xiàn)報(bào)道測定人血中美羅培南的方法，分別采用了沉淀蛋白質(zhì)、超濾后直接進(jìn)樣等樣品前處理方法［3－5］。沉淀蛋白質(zhì)法以乙腈沉淀蛋白質(zhì)后采用二氯甲烷清洗上清液，步驟繁瑣，并且二氯甲烷毒性較大，對人體和環(huán)境有一定的危害。超濾后直接進(jìn)樣的方法需要特殊的儀器設(shè)備。本研究參考文獻(xiàn)報(bào)道的固相萃取法處理樣品［6］，并做了改進(jìn)，選擇了適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)，減少了血漿樣品體積，保證了固相萃取處理過程和測定過程的可控性和準(zhǔn)確性，減少了病人采血的痛苦。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，健康志愿者單次靜脈滴注美羅培南0.5g后，血漿峰濃度為（21.1±10.7）μg／ml［7］。連續(xù)性腎臟替代治療病人靜脈滴注美羅培南1.0g后，血漿峰濃度為（48.5±12.3）μg／ml［5］。燒傷病人靜脈滴注美羅培南0.5g后，血漿峰濃度為（36.4±10.5）μg／ml［8］。本方法可以在0.5～75μg／ml的線性范圍內(nèi)準(zhǔn)確、快速測定血漿中的美羅培南，能夠滿足美羅培南人體藥動(dòng)學(xué)研究的需要。

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