乳酸桿菌S-層蛋白研究進展

北京大北農科技集團股份有限公司

飼用微生物工程國家重點實驗室 王 凡 李曉清 劉 婷 王安如＊

大量研究證實乳酸桿菌制劑對促進動物生長、增強抗病力、調節免疫機能等方面均有較好的作用效果。乳酸桿菌與宿主細胞的黏附是乳酸菌發揮生理作用的基礎，通過黏附于腸上皮細胞表面，定植形成穩定的菌群，抑制病原菌對宿主的定植、移位和感染，維護腸黏膜的完整性，保護宿主腸道上皮細胞免受侵襲，而且黏附于腸道的益生菌可起到免疫調節作用，維持腸道健康高效的生理功能。

細菌的黏附可分為特異性黏附和非特異性黏附（Ofek等，1994）。特異性黏附是通過細菌與黏膜上皮細胞受體的結合；非特異性黏附則是通過疏水、靜電等進行作用。早期的研究發現，乳酸桿菌細胞壁中的脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）和細胞外多糖（EPS）參與了乳酸桿菌和宿主細胞之間的黏附，其中LTA起主要作用 （Granato等，1999），近年來的研究多集中在乳酸桿菌中介導黏附的表面蛋白（Rinkinen等，2003）。其中研究較為清楚的是 S-層蛋白（S-layer protein，SLP），目前普遍認為S-層蛋白是乳酸菌的黏附素之一，本文就乳酸桿菌S層蛋白的結構、生物學功能、應用等方面作一綜述。

1 乳酸菌S-層蛋白的結構與性質

S-層蛋白廣泛存在于古細菌和真細菌表面，是由蛋白質組成的晶格狀結構，位于細胞壁或細胞膜外層，其中乳酸菌S-層蛋白分子質量為40～71 kDa，是目前已知分子質量最小的S-層蛋白，占菌體總蛋白的10%～15%，一般疏水性氨基酸占31.9%～38.7%，含有大量谷氨酸和天冬氨酸（15%），賴氨酸含量也相當高（10%），極少存在含硫氨基酸 （孫明等，2002；Sara和Sleytr，2000）。 高等電點（PI為 9.35 ～ 10.4）是乳酸菌 S-層蛋白的最大特征（Sleytr 和 Sára，1997；Bro..ckl等，1991）。乳酸桿菌S-層蛋白的同源性主要集中于C端，該區域主要負責蛋白對細胞外膜的錨定作用，而N端的區域主要與蛋白的自身組裝及對細胞的黏附作用相關，變異較大（Sára等，1994）。S-層蛋白二級結構分析表明，20%的氨基酸構成α-螺旋，40%為β-折疊，β-轉角與非周期性折疊為5%～45%。許多古菌和G+細菌的S-層蛋白被糖基化，可與糖鏈共價結合，在有些S-層蛋白中還有磷酸化修飾作用（Schaffer 和 Graninger2001；Messner 等 ，1997）。乳酸菌中只有布氏乳桿菌（L.buchneri）發現具有多聚糖結構（Fogh等，1997）。但是大多數乳桿菌S-層蛋白未發現類似結構 （Darfeuille-Michand等，1990）。目前，研究表明，S-層蛋白存在于許多乳桿菌中，如短乳桿菌（L.brevis）、瑞士乳桿菌（L.helveticus）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）和（L.gallinarum）等，而約氏乳桿菌（L.johnsonii）和格氏乳桿菌（L.gaserri）等被稱為B群嗜酸乳桿菌的一類乳酸菌并不含有S-層蛋白 （Hagen 等，2005，Boot等 1996b；Boot等，1996a）。

2 乳酸菌S-層蛋白基因

目前，只有少數乳酸桿菌的S-層蛋白基因被克隆并測序，如短乳桿菌 （L.brevis）（Vidgren等，1992）、 嗜酸乳桿菌 （L.acidophilus）（Boot和Kolen，1993）、 瑞士乳桿菌 （L.helveticus）（Callegari等，1998）和卷曲乳桿菌（L.crispatus）（Sillanp a..a..等，2000）等。一些乳酸桿菌的SLP基因已被收錄在 GeneBank數據庫中。有研究發現，乳酸菌中普遍存在多個S-層蛋白基因，如短乳桿菌（L.brevis）ATCC 14869就含有 3個 S-層蛋白基因：slpB、slpC 和 slpD（Vidgren等，1992）。 嗜酸菌乳桿菌都具有兩個S-層蛋白基因，如嗜酸乳桿菌 （L.cripatus）ATCC 4356 和 卷 曲 乳 桿 菌 （L.crispatus）JCM 5810，其中一個基因可在細菌中得到表達，而另一個則為沉默型 （Boot等，1996b；Boot等，1995；Boot和 Kolen，1993）。 陳雪燕（2007）利用 RT-PCR、Western blot 和 ELISA等技術對卷曲乳桿菌 （L.crispatus）ZJ001的研究也表明，該菌含有兩個S-層蛋白基因，slpA與slpB基因，slpB為沉默基因。同時，不同的乳酸菌具有不同的S-層蛋白基因結構。嗜酸乳桿菌（L.cripatus）ATCC 4356中的兩個slp基因間隔3 kb，并且在slp基因片段中處于相對的位置（Avall-Ja..a..skela..inen 等，2002）；短乳桿菌（L.brevis）ATCC 14869中的 slpB與 slpC相鄰，而離slpD 較遠（Jakava-viljanen 等 ，2002）；卷曲乳桿菌 （L.crispatus）ZJ001的 S-層蛋白基因 slpA和slpB位于長約9.0 kb的slp片段上，間隔約4.5 kb。

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）的 slp 在 C端區域有著高度的相似性，而在N端區域變化很大（Sillanpa..a..等，2000）。 然而，嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）的 slp 在整個序列都表現著高度的相似性。嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）的信號序列相似水平很大。DNADNA雜交試驗證實，分類上相近的乳酸桿菌，其S-層蛋白序列也存在一定的同源性 （Boot和Pouwels，1996c）。 布 氏 乳 桿 菌 （L.buchneri）DSM 20057的染色體和短乳桿菌（L.brevis）ATCC 14869的slpA基因DNA之間具有很強的雜交信號，表明前者含有slpA同源序列。

3 S-層蛋白的功能

目前，大部分乳酸桿菌S-層蛋白功能并不清楚，只有部分得到證實。已有的報道表明，S-層蛋白在對宿主細胞的黏附中起作用，而其中一些蛋白質能有效阻止致病菌對上皮細胞的黏附（Johnson-Henry 等，2007）。 L.brevis 14869 對豬的腸道上皮細胞也有很強的黏附力，但并未證實slpA是否參與了黏附過程。L.crispatus JCM 5810的S-層蛋白 Cbs A介導與腸下細胞外基質組分膠原質和層黏連蛋白的黏附（Antikanen等，2002）。 L.acidophilus M 92的 S-層蛋白介導細菌對豬腸道上皮細胞的黏附（Hynonen等，2005）。

有研究者利用Western Blot方法，研究辣根過氧化物（HRP）標記的黏蛋白受體與羅伊氏乳桿菌 JCM 1081表面蛋白的結果顯示，存在于JCM 1081菌株細胞壁表面的兩種蛋白 Mr 29000和 Mr 14000為乳桿菌 JCM1081的黏附相關蛋白。有研究表明，在陸生動物與水產動物中，乳酸菌的黏附具有菌種特異性，而無宿主特異性（Rinkinen 等，2003）。 陳營等（2006）利用黏液模型研究了從健康牙鲆腸道中分離篩選出的乳桿菌L15與嗜酸乳桿菌ATCC 4356表面蛋白中黏附相關蛋白的種類，蛋白質印跡結果顯示，L15表面蛋白中分子質量為61.8 kDa和54.6 kDa的蛋白質分別參與對牙鲆和鯉魚黏液的黏附過程，ATCC 4356中分子質量分別為43.0 kDa和63.3 kDa的兩個表面蛋白參與對牙鲆黏液的黏附，而分子質量為43.0 kDa的蛋白參與對鯉魚黏液的黏附。同時，腸黏液中參與黏附的蛋白質種類不隨著乳桿菌種類的改變而改變，但是相應的細菌表面參與黏附的蛋白質會隨著腸黏液種類的變化而有所不同。陳雪燕（2007）從豬腸道分離具有耐酸耐膽鹽和強黏附力的乳酸桿菌ZJ001，除去S-層蛋白后，ZJ001的自凝現象和對HeLa細胞的黏附力降低。同時，菌株ZJ001能競爭抑制鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7對HeLa細胞的黏附，利用LiCl去除S-層蛋白后可降低ZJ001對病原菌黏附的拮抗作用，表明了S-層蛋白在ZJ001對病原菌黏附的拮抗中發揮了重要的作用。

4 S-層蛋白的應用

S-層蛋白在分子工程和生物材料上具有廣闊的應用前景，例如，S-層可以開發成分子篩，也可作為功能分子共價吸附固定的基質，如酶和抗體、親和膜、生物傳感器以及固相免疫分析；利用分子遺傳技術，可使外源蛋白得到表達，在細胞表面展示，從而開發基因工程疫苗、全細胞固定化酶等（Breitwieser等，1996）。現在已經成功地表達了某些生物活性蛋白或多肽在細胞表面，如利用芽孢桿菌slp展示了果聚糖蔗糖酶、α-淀粉酶、金屬硫蛋白等（Mesnage等，1999）。

目前，關于乳酸桿菌slp基因的應用研究是利用其啟動子或信號序列產生胞內或胞外異源蛋白。slpA基因的分泌信號已成功地應用于許多異源蛋白的分泌和輸出（Savijoki等，1997）。研究表明，短乳桿菌（L.brevi）ATCC 8287及嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）ATCC 4356的slpA基因的啟動子在不同的乳酸桿菌中都能獲得較高產量的胞內蛋白，但啟動子的功能與所用的宿主和報告蛋白有關。另外，利用乳酸桿菌S-層蛋白的受體結合區域異源表層表達，可使不具有黏附力的乳酸桿菌轉變為具有黏附力。將卷曲乳桿菌（L.crispatus）的cbsA蛋白結合到干酪乳桿菌（L.casei）細胞壁上，使其與干酪乳桿菌蛋白酶PrtP細胞壁分類信號聯合，可使干酪乳桿菌黏附到膠原蛋白上，但其黏附力較野生型卷曲乳酸桿菌低。嗜酸乳桿菌 （L.acidophilus）ATCC 4356具有水解酶的活性，并且通過克隆使其在枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis）具有水解酶活性的C端進行表達，結果顯示，表達后的蛋白具有水解酶活性（Mariano等，2008）。

5 展望

良好的定植能力是乳酸菌發揮生理作用的基礎，乳酸菌表面黏附因子決定了乳酸菌能否發揮作用。通過研究S-層蛋白在乳酸菌對宿主細胞的黏附過程中的作用，為研究乳酸菌益生功能提供理論依據，并能為菌株的改造，提高益生菌株黏附性能提供方向。同時，由于S-層蛋白的空間結構和基因特點，使其在納米生物材料、仿生學、基因工程疫苗、生物傳感器等方面均得到應用。

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