黑豆多酚氧化酶的分離純化及其酶學(xué)特性研究

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 張寬朝 全明吉

黑豆，為豆科植物的種子，亦稱烏豆、黑大豆。現(xiàn)代藥理研究證實，黑豆含有豐富的蛋白質(zhì)、卵磷脂、脂肪、維生素以及黑色素、煙酸等，具有抗氧化、增強免疫力、抗炎、抗癌、防止脂質(zhì)過氧化等重要功能（王敏等，2008；陳穎和徐巍，2008）。多酚氧化酶（PPO）是自然界分布較為廣泛的一種氧化還原酶，是一類含銅元素的金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中。本試驗以黑豆為試驗材料，對其中的多酚氧化酶進(jìn)行了分離純化及酶學(xué)特性研究，以期為進(jìn)一步研究多酚氧化酶的基本特性和調(diào)控黑豆的加工過程提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 黑豆：廬州黑豆，市售，經(jīng)剝皮后用粉碎機破碎，備用。DE-52為Whatman分裝；透析袋為Usa分裝；PEG-20000為Ameresco分裝；硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯二酚、PVP、EDTA、Tris、氫氧化鈉、氯化鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250等均為國產(chǎn)分析純。SP-722E分光光度計（上海光譜儀器有限公司），TGL-20M臺式高速冷凍離心機 （湘儀離心機儀器有限公司），MC99-3自動液相色譜分離層析儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），粉碎機 （天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑豆多酚氧化酶酶活性測定 取2支試管，一支作為空白管加入3 mL 1/15 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，另一支加2 mL 1/15 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，1 mL 0.1%鄰苯二酚，搖勻。2支試管同時于50℃恒溫預(yù)熱5 min，分別加入0.5 mL酶液，立即計時，搖勻。準(zhǔn)確恒溫反應(yīng)15 min，迅速取出于420 nm處比色讀取 OD值 （張雅芬等，2005）。PPO活力單位定義為 ：每分鐘OD值變化0.001為一個酶的活力單位（U）。

1.2.2 黑豆多酚氧化酶的分離純化

1.2.2.1 粗酶液的提取 稱取粉碎后黑豆粉，按照1∶2質(zhì)量比例分別加入經(jīng)過預(yù)冷（4℃）的 1/15 mol/L、pH為5.8、6.8和7.6的磷酸緩沖液 （內(nèi)含5%的PVP），于4℃下浸提2 h，用4層脫脂紗布過濾，濾液于4℃下10000 r/min，離心15 min，上清液即為多酚氧化酶粗酶液。

1.2.2.2 硫酸銨分級沉淀 邊攪拌邊向粗酶液中加入固體硫酸銨粉末至飽和度為30%，4℃、10000 r/min離心10 min，棄去沉淀，繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨至飽和度為80%，4℃、靜置過夜，4℃、10000 r/min離心 15 min，傾倒上清液，留沉淀備用。

1.2.2.3 透析脫鹽 上述沉淀復(fù)溶于10 mL 1/150 mol/L、pH為 6.8的磷酸緩沖液，將復(fù)溶后的酶液裝入已處理好的透析袋中，4℃以蒸餾水透析6 h后，于1/150 mol/L、pH 6.8的磷酸緩沖液脫鹽透析過夜。

1.2.2.4 DE-52層析純化 DE-52依照常規(guī)處理，裝層析柱，1/150 mol/L、pH 6.8磷酸緩沖液平衡過夜，將經(jīng)飽和硫酸銨分級沉淀并已透析脫鹽的酶液上樣，以0至1 mol/L NaCl，pH 6.8磷酸緩沖液梯度洗脫，自動部分收集器收集洗脫液，每管5 min。合并收集相鄰酶活性峰，PEG20000濃縮備用。

1.2.3 酶學(xué)特性研究

1.2.3.1 反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作 按1.2.1酶活測定體系加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液、0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預(yù)熱5 min，加入酶液，分別于 50 ℃恒溫準(zhǔn)確反應(yīng) 5、10、20、25、30、40 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.2 最適pH 按1.2.1酶活測定體系，分別加入 pH 5.6、6.2、6.8、7.4、8.0 的磷酸鹽緩沖液，0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預(yù)熱5 min，加入酶液，分別于50℃恒溫準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.3 最適溫度 按1.2.1酶活測定體系，分別加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液、0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預(yù)熱5 min，加入酶液，分別于20、30、40、50、60 ℃恒溫準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.4 最適底物濃度 按1.2.1酶活測定體系，加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，再分別加入0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.1%、0.2%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預(yù)熱5 min，加入酶液，于50℃恒溫準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.5 金屬離子對黑豆多酚氧化酶活性的影響按1.2.1酶活測定體系，分別加入1.0、1.5、3.0 mg/mL MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、CaCl2，pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液，0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預(yù)熱5 min，加入酶液，于50℃恒溫準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.6 抑制劑對黑豆多酚氧化酶活性的影響按1.2.1酶活測定體系，分別加入1.0、1.5、3.0mg/mL含抗壞血酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、Na2SO3， pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預(yù)熱5 min，加入酶液，于50℃恒溫準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，迅速取出測定酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH抽提法對黑豆PPO活性的影響由圖1可知，在提取溫度，浸提時間和PVP含量相同的情況下，pH對酶活的影響較大。分析抽提酶液， 酶活性依次為 pH 6.8＞pH 5.8＞pH 7.6，pH 6.8時PPO活性最大，因此，后續(xù)試驗過程中選取pH 6.8磷酸緩沖液作為黑豆多酚氧化酶的提取溶液。

2.2 黑豆多酚氧化酶的DE-52層析 取黑豆粉末，經(jīng)30%～80%飽和硫酸銨分級沉淀，1/150mol/L、pH 6.8的磷酸緩沖液透析脫鹽過夜，上DE-52陰離子交換層析柱，以0至1mol/L NaCl，pH 6.8磷酸緩沖液（200 mL+200 mL）進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果見圖2。從圖2可知，30%～80%硫酸銨分級沉淀初步純化的黑豆PPO，經(jīng)離子交換層析分離，僅有1個活性峰。

2.3 PPO的反應(yīng)進(jìn)程曲線 從圖3可知，在30 min以內(nèi)，PPO催化反應(yīng)的酶活力與反應(yīng)時間基本成線性關(guān)系。在反應(yīng)30 min后，PPO反應(yīng)進(jìn)程曲線逐漸變平。這是因為隨著催化反應(yīng)的進(jìn)行，底物鄰苯二酚在逐漸減少，而產(chǎn)物的生成量逐漸增多，對PPO酶的反饋抑制作用逐步加強，從而酶促活力增加速度下降。

2.4 黑豆多酚氧化酶的最適pH pH對PPO的影響一般是通過改變酶的構(gòu)象實現(xiàn)的。pH不但影響酶活性基團(tuán)的解離，也會影響底物的解離。由于PPO是含銅酶，pH較高或者較低都會導(dǎo)致Cu2+的解離及蛋白質(zhì)的變性，從而使PPO失去活性。有研究報道，不同植物的PPO或同一植物基因家族中不同PPO基因的表達(dá)產(chǎn)物，其最適pH可能有所不同。蓮藕中的PPO以鄰苯二酚為底物，最適pH為7.0（黃建韶和田宏現(xiàn)，2002）。而煙草中的PPOI以鄰苯二酚為底物，最適pH為7，PPOII的最適pH為6（戴亞等，2001）。由圖4可知，當(dāng)pH為5.5～6.8時，隨著pH的逐漸增加，黑豆PPO的活性逐漸增強，當(dāng)pH達(dá)到6.8時，PPO酶活性達(dá)到最高峰，然后，隨著pH的繼續(xù)增加，酶的活性逐漸減弱。因此，可知黑豆PPO的最適pH為6.8，在近中性范圍內(nèi)。

2.5 黑豆多酚氧化酶的最適溫度 從圖5可知，在20～50℃，酶活性隨著溫度的升高而逐漸上升，50℃時酶活性最高。隨著溫度的進(jìn)一步升高，酶活性呈不斷下降的趨勢。這是因為溫度對酶反應(yīng)的影響可歸納為兩個方面，一是酶作為一種生物催化劑，隨著溫度的升高，活化分子數(shù)增多，催化效率增加，酶促反應(yīng)速度加快；另一影響在于酶促反應(yīng)具有其生物學(xué)性質(zhì)，反應(yīng)溫度升高到一定程度，隨著酶蛋白的變性程度加深，酶會逐步喪失其催化活力。因此，在20～50℃，可能是第一種效應(yīng)起主導(dǎo)作用，適度提高溫度，利于對酶朝著有利于底物發(fā)生作用的催化構(gòu)象轉(zhuǎn)變，而此后繼續(xù)升高溫度則會破壞酶的活性構(gòu)象，酶活性不斷下降。因此，黑豆PPO的最適反應(yīng)溫度是50℃，與番石榴最適反應(yīng)溫度是50℃結(jié)果相一致（楊昌鵬等，2006）。

2.6 底物濃度對酶活力的影響 從圖6可知，隨著底物濃度增大，PPO酶活力逐漸增高，但當(dāng)?shù)孜餄舛鹊竭_(dá)一定值時 （0.1%），隨著底物濃度的增加，PPO酶活力增高幅度降低。其原因在于當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，酶蛋白處于過量狀態(tài)，而隨著底物濃度逐漸增加，越來越多的底物與酶分子結(jié)合，此時，酶將逐漸飽和，直到達(dá)到最大飽和值。因此，以鄰苯二酚做反應(yīng)底物時，黑豆PPO最適反應(yīng)底物濃度為0.1%。

2.7 金屬離子對黑豆多酚氧化酶活性的影響以磷酸鹽緩沖液內(nèi)含金屬離子作為反應(yīng)體系，測定不同金屬離子對黑豆PPO活性的影響，結(jié)果見圖7和圖8。因Cu2+作為PPO酶的輔因子，參與酶的組成，易在分離提純過程中丟失，所以，在供試濃度范圍內(nèi)，低濃度外源Cu2+的加入，能夠激活黑豆PPO酶活性。從圖7可知，可提高酶活性至225%，而高濃度Cu2+則抑制PPO酶活性。由圖8可知，Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+、Ca2+對酶活性均有抑制作用， 在供試濃度范圍內(nèi)，Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+對PPO活性的抑制均達(dá)到50%以上，而Ca2+對酶活性的抑制為50%左右。

2.8 抑制劑對黑豆多酚氧化酶活性的影響 從圖9可知，在供試濃度范圍內(nèi)，抗壞血酸、EDTA、Na2SO3均對黑豆PPO活性具抑制作用。抗壞血酸對PPO活性的抑制作用其機理可能在于維生素C作為PPO輔基銅離子的螯合劑與銅離子發(fā)生鍵聯(lián)，導(dǎo)致PPO失活；或者是因為維生素C作為醌類物質(zhì)的還原劑，將PPO酶促褐變反應(yīng)的中間產(chǎn)物鄰二醌還原成鄰二酸，阻止了醌類物質(zhì)進(jìn)一步自發(fā)聚合形成褐色物質(zhì)因而抑制了褐變，但是，抗壞血酸本身容易發(fā)生非酶褐變。EDTA屬于金屬離子螯合劑，對PPO活性抑制作用的機制是因為EDTA具有較強的Cu2+螯合能力，能夠很大程度上螯合PPO中的Cu2+，因此形成穩(wěn)定的螯合物而抑制了PPO的活性。Na2SO3對多酚氧化酶反應(yīng)體系的抑制作用可能基于兩個方面，一方面Na2SO3能不可逆地與醌加成，而生成無色的產(chǎn)物，從而抑制了PPO的褐變，另一方面，Na2SO3可能還有漂白和抑制微生物的作用（程建軍等，2002）。在生產(chǎn)實踐中，抗壞血酸為生物有機體本身所固有的營養(yǎng)成分，其安全性較高，所以可以作為理想的工業(yè)用抑制劑，而對于亞硫酸鈉而言，則要充分考慮其在生物制品中的殘留問題（楊昌鵬等，2006；程建軍等，2002）。

3 結(jié)論與討論

試驗對黑豆中的多酚氧化酶進(jìn)行了抽提，分離純化，并進(jìn)行了酶學(xué)特性的研究，結(jié)果表明，黑豆多酚氧化酶的最適反應(yīng)pH為6.8，最適反應(yīng)溫度為50℃，最適底物濃度為0.1%，在供試濃度范圍內(nèi)，高濃度 Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+、Ca2+及抗壞血酸、EDTA、Na2SO3均是其抑制劑。

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