星點(diǎn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面法優(yōu)選肺炎口服液的提取工藝

梁喆，張麗，呂艷莉，陳惠錚

(1．哈爾濱市兒童醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150010;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

大黃牡丹湯為張仲景《金匱要略》中的一首名方，而肺炎口服液為大黃牡丹湯的加減方，方由石膏、甘草、綿馬貫眾、牡丹皮、蘆根、大黃、鉤藤、板藍(lán)根、地骨皮、蒲公英10味中藥組成，具清熱解毒、止咳定喘的功效，主治肺熱壅盛型病毒性肺炎、氣管炎。肺炎口服液是哈爾濱市兒童醫(yī)院特色中藥制劑，方中大黃瀉火逐瘀，通便解毒;牡丹皮涼血清熱，活血散瘀，二者合用，共瀉腸腑濕熱瘀結(jié)，共為方中君藥，且符合中醫(yī)肺與大腸相表里的理論。

中藥的提取及制備工藝最常用的優(yōu)化方法是正交設(shè)計(jì)法［1］和均勻設(shè)計(jì)法［2］，但是這兩種方法存在一定的不足。星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法作為優(yōu)選工藝的方法之一，彌補(bǔ)了正交設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法的缺限，在國內(nèi)外廣泛運(yùn)用［3－6］。星點(diǎn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design，CCD)采用線性或非線性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以減少試驗(yàn)次數(shù)、并且提高了試驗(yàn)的精密度。響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計(jì)方法，通過對(duì)響應(yīng)面等值線的分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)以大黃酸、丹皮酚和芍藥苷的含量為指標(biāo)，采用3因素5水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)表安排提取工藝實(shí)驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選處方的提取工藝，為新劑型的開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

美國Waters高效液相色譜儀(2695溶劑管理系統(tǒng)，2996二極管陣列檢測(cè)器，美國Waters柱溫箱，Empower2工作站);PTHW型電子恒溫電熱套(鞏義市予華儀器有限公司);FA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DZG6050SA真空干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);KQ－50B超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1．2 藥品與試劑

芍藥苷(110736－200933)、丹皮酚(110708－200506)、大黃酸對(duì)照品(0757－200206)(中國藥品生物制品檢定所);石膏、甘草、牡丹皮、大黃等10味藥材(哈藥集團(tuán)世一堂飲片廠，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)劉樹民教授檢驗(yàn)，均符合《中國藥典》2010年版一部規(guī)定);水為重蒸水;甲醇(色譜純，天津四友試劑廠);其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 芍藥苷、丹皮酚含量測(cè)定方法［7］

2．1．1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18色譜柱(4.6mm ×150mm，5μm);柱溫:40℃;流動(dòng)相:甲醇 －0.05%磷酸水溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1;流速:1．0ml/min;進(jìn)樣量:10μl;檢測(cè)波長:芍藥苷230nm，丹皮酚274nm。此條件下芍藥苷和丹皮酚色譜峰與相鄰成分可達(dá)基線分離。

表1 梯度洗脫時(shí)間程序

2．1．2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷和丹皮酚對(duì)照品，加甲醇制成每1m l分別含芍藥苷0.156mg、丹皮酚0.301mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2．1．3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約20ml，精密量取，置圓底燒瓶中，蒸發(fā)溶劑至干，殘?jiān)蛹状?m l溶解，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)過濾，取續(xù)濾液，即得。

2．2 大黃酸含量測(cè)定方法［8］

2．2．1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:甲醇 －0.1%磷酸溶液(85∶15);流速為 1．0ml/min;檢測(cè)波長:254nm;進(jìn)樣量:10μl。

2．2．2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大黃酸對(duì)照品適量，置10ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成濃度為0.175mg/ml的溶液。

2．2．3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約20ml，精密量取，置圓底燒瓶中，蒸發(fā)溶劑至干，殘?jiān)?.5mol/l硫酸溶液20ml，置水浴中加熱回流2h，放冷，加氯仿20ml，回流30min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取氯仿液，濾過，酸液再加氯仿提取3次，每次20ml，分別濾過氯仿液，最后用氯仿10ml分次洗滌濾器，合并氯仿液和洗液，加水30ml洗滌氯仿液，棄去水洗液，氯仿液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)過濾，取續(xù)濾液，即得。

2．3 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際，本實(shí)驗(yàn)采用水提取法。實(shí)驗(yàn)中提取次數(shù)和藥材粒徑為非連續(xù)變量，回歸處理困難，因此本試驗(yàn)固定提取次數(shù)為2次，藥材粒徑以通過3號(hào)篩為準(zhǔn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇醇沉濃度(X1)、料液比(X2)和提取時(shí)間(X3)3個(gè)因素為自變量，其中醇沉?xí)r的乙醇體積固定，料液比和提取時(shí)間主要是針對(duì)水提取工藝設(shè)計(jì)的因素，每個(gè)因素確定5個(gè)水平，共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(6個(gè)中心點(diǎn))，以芍藥苷、丹皮酚和大黃酸含量的總和作因變量考察指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)提取工藝條件，運(yùn)用響應(yīng)面分析法分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，因素水平編碼見表2，試驗(yàn)安排和結(jié)果見表3。

表2 提取工藝因素水平編碼

2．4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Design－Expert7．0．0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到醇沉濃度(X1)、料液比(X2)及提取時(shí)間(X3)與提取物總含量之間的二次多項(xiàng)回歸方程，回歸方程為:

Y=4．97+0．88X1+1．19X2+0．39X3+0．025X1X2+0．098X1X3+0．1X2X3+1．03X21+0．85X22+0.91X23

回歸方程系數(shù) r2=0．947 5(r=0．973 3)，說明模型能解釋97．33%響應(yīng)值的變化，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)實(shí)際情況。其校正決定系數(shù)(adj－R2)為0．900 2(r=0.948 7)，表明此模型能解釋94．87%效應(yīng)值變化，因此該模型擬合程度良好。

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。表3回歸方程顯著性檢驗(yàn)，P＜0.000 1，回歸方差顯著性檢驗(yàn)表明，一次項(xiàng)醇沉濃度(X1)和料液比(X2)對(duì)提取物總含量的線性效應(yīng)極顯著(P＜0.01);一次項(xiàng)提取時(shí)間(X3)，二次項(xiàng)中 X21，X22，X23對(duì)提取物總含量的曲面效應(yīng)顯著(P＜0.05);醇沉濃度(X1)和料液比(X2)交互項(xiàng)(X1X2)、醇沉濃度(X1)和提取時(shí)間(X3)交互項(xiàng)(X1X3)、料液比(X2)和提取時(shí)間(X3)交互項(xiàng)(X2X3)的P值均大于0.05，說明各因素間的交互作用不顯著。

表3 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2．5 響應(yīng)面分析及最優(yōu)提取條件的確定 依據(jù)回歸方程，在保持1個(gè)因素編碼值為0時(shí)，借助Design－Expert7．0．0軟件繪制其它2個(gè)因素與響應(yīng)值關(guān)系的三維響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖1。由圖可以看出，醇沉濃度(X1)和料液比(X2)對(duì)提取物總含量的提取影響較為顯著，且響應(yīng)曲面陡峭。

為確定這三個(gè)影響因素的最佳取值，通過Design－Expert7．0．0軟件分析，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，(X)的代碼值分別為0.02，－1.18，－1.40，與之對(duì)應(yīng)的實(shí)測(cè)值醇沉濃度(X1)為75.76%，料液比(X2)為1∶9.19，提取時(shí)間(X3)為2.08h，此時(shí)肺炎口服液中提取物總含量的最大估計(jì)值為10.46mg/ml。

2．6 模型的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證此提取模型方程的適用性，在醇沉濃度、料液比、提取時(shí)間最優(yōu)的水平上，重復(fù)試驗(yàn) 3次，提取物總含量為 10．38mg/ml(RSD為0.37%)，與預(yù)測(cè)值10.46mg/ml吻合極好，說明用此模型指導(dǎo)實(shí)踐具有非常好的效果。

表3 回歸模型方差分析

圖1 各因素與響應(yīng)值關(guān)系的三維響應(yīng)面圖

3 討論

由于星點(diǎn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面優(yōu)化法采用非線性模型擬合，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的次數(shù)越多，越可以提高實(shí)驗(yàn)的精確度，預(yù)測(cè)值越可接近真實(shí)值，故本實(shí)驗(yàn)采用6次重復(fù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法簡便合理、穩(wěn)定，可預(yù)測(cè)性較優(yōu)。

根據(jù)口服液生產(chǎn)的實(shí)際，本提取工藝還考察了醇沉濃度對(duì)于藥效成分的影響。結(jié)果表明，醇沉濃度對(duì)于口服液生產(chǎn)的質(zhì)量有很大的影響。

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法確定了星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的肺炎口服液提取工藝的最優(yōu)條件:醇沉濃度(X1)為75.76%，料液比(X2)為 1∶9.19，提取時(shí)間(X3)為2.08h，在此條件下，肺炎口服液中提取物總含量的最大估計(jì)值為10.46mg/ml，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值相符。

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