補髓生血顆粒對慢性再障患者骨髓單個核細胞內Ca2+水平及不同血液疾病間差別的影響

羅正凱，王金環，孫鳳，雍延禮，孫偉正

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

再生障礙性貧血(AA)作為一種造血負調控亢進“模型”，是一種危害性極大的血液系統疑難病癥。CAA病理機制主要有造血干細胞量和質異常、免疫異常、造血微環境損傷等三個學說。本課題組經過近40年的連續研究，了解和認識慢性再障腎虛病機以及補腎藥物療效機理和環節［1－2］。受體配體結合時引起的細胞內信號轉導通路的變化可能為其重要機理之一。鈣離子(Ca2+)通路作為重要的信號轉導通路基本上可參與到CAA各個環節當中。本實驗搜集CAA患者骨髓樣本，采用流式細胞術(FCM)擬通過對患者骨髓單個核細胞內Ca2+濃度測定，以期進一步探討補髓生血顆粒對慢性再障的治療機制。同時觀察不同血液疾病患者骨髓單個核細胞內Ca2+濃度水平，為血液疾病的診斷和治療提供新的思路。

1 研究對象

本次觀察研究對象共納入CAA患者55例，均來源于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院血液內科2010年1月～2011年3月期間住院或門診治療的CAA患者，隨機分為治療組和對照組，治療組55例，其中腎陽虛型30例，腎陰虛型25例;對照組53例。治療組予以補髓生血顆粒治療，對照組則予以再造生血片治療。另選取30例健康體檢志愿者作為正常對照組。

2 研究方法

依照文獻［3］所述方法，使用淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞。依照Fluo－3－AM(進口自美國intrigen公司)試劑盒所述方法對BMMC內Ca2+染色，將已分離完畢的BMMC分為A、B兩管，在A管中加入D－PBS，B管中加入 Fluo－3AM熒光素，避光孵育1h。使用美國Becton Dickinson公司生產Facscalibour流式細胞儀檢測，利用CELLQuelt功能軟件進行參數的獲取和數據分析，激發光為488nm，波長為526nm，以陰性細胞為對照，用橫坐前向散射光和縱坐側向散射光確定細胞群，開窗定標，計算窗內細胞1萬個在FL1－H的直方圖上，調整并確定電壓及最大倍數，在此基礎上計算被染上的Fluo－3的熒光強度。計量資料用(s)表示，組間均數比較采用方差分析，運用SPSS 11.0統計軟件計算。

3 研究結果

3.1 補髓生血顆粒對CAA患者骨髓單個核細胞內Ca2+濃度的影響

CAA患者療前各組骨髓單個核細胞內Ca2+濃度均高于正常對照組(P＜0.05);經過治療，患者骨髓單個核細胞內Ca2+濃度較療前均有所下降(P＜0.05)，且治療組下降程度優于對照組(P＜0.05)，但療后兩者的細胞內Ca2+濃度均未達正常組水平(P＜0.05)。治療前治療組中腎陽虛型CAA患者BMMC內Ca2+濃度與腎陰虛型經較，無顯著性差異(P＞0.05);經治療后，腎陽虛組細胞內Ca2+濃度低于腎陰虛組，但無統計學差異(P＞0.05)。各組細胞內Ca2+濃度比較見表1。

表1 CAA患者骨髓單個核細胞內Ca2+濃度

3.2 不同血液疾病骨髓單個核細胞內Ca2+濃度差異比較 見表2。

表2 不同血液疾病骨髓單個核細胞內Ca2+濃度比較

慢性再障組(CAA)、骨髓增生異常綜合征組(MDS)骨髓單個和細胞內Ca2+濃度高于正常組(P＜0.05);慢性血小板減少性紫癜組(CITP)、缺鐵性貧血組(IDA)與正常組比較，無顯著性差異。CAA患者明顯低于MDS組(P＜0.05)。CAA組與CITP組比較，無顯著性差異。MDS組均明顯高于IDA組與CITP組(P ＜0.05)。

4 結論

Ca2+在細胞的生命活動中具有重要作用，所有類型細胞的各種功能均不同程度地受Ca2+調控。細胞內鈣不僅作為一種重要的第2信使廣泛參與細胞的運動、分泌、代謝和分化等多種細胞功能活動的調節，而且胞內鈣離子濃度的變化與調控對于參與維持存在于細胞質膜或細胞器膜兩側的跨膜梯度差，以及介導細胞對外界刺激的應答反應具有重要的調節作用［4］。對于靜息和受刺激時胞內鈣離子濃度的準確了解，是確定鈣離子在刺激反應級聯中作用的重要因素［5］。在大多數細胞，胞內鈣離子濃度的瞬間增加有兩種可能的來源:一是胞外Ca2+通過Ca2+通道的開啟進入胞內;二是胞內鈣庫(如內質網等)向胞質釋放出Ca2+。細胞內儲存鈣的釋放是通過IP3和RyRs等受體操縱性鈣通道完成的［6］。

鈣離子作為細胞內的信息傳遞物質，具有調節細胞功能、參與信號跨膜傳遞以及介導細胞對外界刺激的應答反應等重要作用［7］。有學者研究表明，CAA患者其造血干細胞存在凋亡現象，是通過IFN－r、TNF－α作用靶細胞后觸動靶細胞CD95表面蛋白受體，進而引起靶細胞內的連鎖生化反應，包括Ca2+升高，從而使DNA降解而凋亡［8］。

近年來，信號轉導通路逐漸成為研究的熱點，有學者認為，PLA－IP3通路對于細胞內Ca2+的釋放與調節起著重要作用，是形成細胞內生理變化的重要因素。本研究結果表明，再生障礙性貧血患者骨髓單個核細胞內Ca2+濃度明顯高于正常組，經過藥物干預，各組細胞內Ca2+水平下降。提示細胞內Ca2+的升高可能是骨髓造血功能異常的標志性指標之一，這為下一步通過干預PLA－IP3通路實現Ca2+水平改變而達到治療再生障礙性貧血的目的提供了啟發。

本課題組還使用流式細胞儀技術對不同種類血液疾病患者骨髓單個核細胞內Ca2+濃度進行了檢測。表明缺鐵性貧血(IDA)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)與正常組無顯著性差異，而骨髓增生異常綜合征(MDS)患者則明顯高于正常組。提示MDS等骨髓增殖類疾病與細胞內Ca2+的關系更為密切，而缺鐵性貧血、特發性血小板減少性紫癜患者則與健康組無明顯差異，此類疾病預后較好。不同種類血液疾病細胞內Ca2+濃度的觀察，為今后各類疾病間的鑒別診斷提供了新的思路。

［1］王小東，孫勁暉，梁正賢，等.補髓生血顆粒對慢性再生障礙性貧血患者骨髓AKT磷酸化水平的影響［J］.中醫藥學報，2011，39(2):41－43.

［2］施海濤，王金環，孫岸，等.補腎生血法對慢性再生障礙性貧血患者信號轉導MAPK通路的影響［J］.中醫藥學報，2011，39(4):49－52.

［3］劉娜.補腎生血法對慢性再生障礙性貧血骨髓造血粘附FAK/P13K通路及 RhoGTP酶的影響［D］.哈爾濱:黑龍江中醫藥大學，2010.

［4］Loughrey CM，MacEachern KE，Cooper J，et al.Measurement of the dissociation constant of Fluo－3 for Ca2+in isolated rabbit cardiomyocytes using Ca2+wave characteristics［J］.Cell Calcium，2003，34(1):1－9.

［5］Liu Y，Zhong Y，Pei J，et al.Inhibitory effect of leptin on growth hormone secretion of GH3 cells:involvement of cell proliferation，apoptosis and intracellular free Ca2+［J］.Cytokine，2009，46(2):245 －250.

［6］Yanagida E，Shoji S，Hirayama Y，et al.Functional expression of Ca2+signaling pathways in mouse embryonic stem cells［J］.Cell Calcium 2004，36(2):135 －146.

［7］Paredes RM，Etzler JC，Watts LT，et al.Chemical calcium indicators［J］.Methods，2008，46(3):143 －151.

［8］王祥麒.CAA患者造血干細胞內Ca2+含量、CD95+表達水平及相關因素的研究［J］.河南大學學報(醫學版)，2004，4(23):9－10.