MTT法檢測香葉木苷對臍靜脈內皮細胞增殖抑制的影響

蘇秀莉，盧衛紅，張浩，趙越

(哈爾濱工業大學，黑龍江 哈爾濱 150001)

香葉木苷(dosmin，3'，5，7 － 三羥基 4'－ 甲氧基黃酮－7－蕓香糖)是從茜草科藥用植物蓬子菜(Galium verum L．)中提取出的含量豐富黃酮苷類化合物［1］，蓬子菜是中國東北的一種野生植物，這種植物以維生素的優良的食物來源而著稱，它還包含綠原酸，水楊酸和黃酮類等物質，在東北民間藥用歷史悠久，具有清熱祛濕、活血止癢的功效，近10余年來，臨床應用不同劑型治療下肢靜脈炎療效顯著。香葉木苷具有增加靜脈張力，改善靜脈通透性，改善微循環的作用，從而減輕肢體水腫，在國內已有多篇文獻臨床報道［2－4］。香葉木苷具有消炎和止痛的藥效，柑橘中獲得的類黃酮香葉木苷具有抗虐、抑制癌細胞增殖作用，還可以作為中樞神經鎮靜劑并具有輔助睡眠，縮短入睡時間的顯著功效，同時它還是治療疾病的特殊藥效物質，可以增加肌肉強度，抵抗靜脈血管炎癥，慢性血管炎，風濕病關節炎，抗氧化，抗脂質過氧化的功效，細胞保護，治療急性和慢性的胃潰瘍和十二指腸潰瘍［5－7］。本課題組前期實驗從蓬子菜中分離了香葉木苷，并且進行了香葉木苷在大鼠體內的藥代動力學等研究［8］。

臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，簡稱HUVECs)是一種干細胞，能無限次傳代(理論上)，易于實驗操作。

MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。最終結果在490nm波長處測定其光吸收值，按下面公式計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(IR)=(1－加藥組吸光度/對照組吸光度)×100%。

在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

香葉木苷的研究前期主要集中在從蓬子菜中分離提取純化及在動物體內的功能，幾乎沒有作用于細胞方面的研究，本實驗從香葉木苷作用于臍靜脈內皮細胞入手，優化出最佳加藥濃度和最優加藥實驗，為后期研究相關香葉木苷作用于細胞的蛋白質組研究奠定基礎。

1 材料

1．1 細胞來源 人臍靜脈內皮細胞株由哈爾濱醫科大學提供。

1．2 藥材與試劑 香葉木苷(由蓬子菜分離提取，蓬子菜采自黑龍江省鏡泊湖地區和哈爾濱郊區，由黑龍江中醫藥大學藥學院于加賓教授鑒定，香葉木苷由哈爾濱工業大學盧衛紅副教授分離提取［9］);改良型RPMI－1640培養基、胎牛血清和胰蛋白酶(美國HyClone公司);四甲基偶氮唑藍(美國Amresco公司);二甲基亞砜(DMSO)(美國Amresco公司);青－鏈霉素(碧云天公司)。

2 方法

2．1 培養基的配置 H－1640培養基按照90%RPMI－1640培養基、10%胎牛血清，青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL比例配置。配置好的培養基封口放入4°冰箱保存。

2．2 臍靜脈內皮細胞的復蘇及培養 將凍存細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中并輕輕晃動使其迅速融化，立即放入離心機離心(1 000r/min，5min)，吸去上層液體，加入1ml培養基輕輕吹打，使細胞分散成單個，轉移至25cm2培養瓶中，再補加入1mL培養基，放入37℃，CO2體積分數為5%的溫箱中培養。24h后更換培養基，除去未貼壁的細胞，2～3天更換培養基［10］。臍靜脈內皮細胞的傳代培養:用胰蛋白酶EDTA消化法。待細胞融合成單層后，棄去舊培養液，用PBS液洗滌瓶壁，加2mL，25g/L胰蛋白酶，作用1min后吸去消化液，室溫下繼續作用，一邊在倒置顯微鏡下觀察，直到細胞皺縮、彼此分離或單層細胞出現網孔狀即可終止消化。加入培養液，吸管吹打，制成細胞懸液，按1∶2比例將細胞懸液接種于培養瓶中，置CO2體積分數為5%的培養箱中，37℃培養。待長滿單層，用同法繼續傳代培養［10］。

2．3 最優藥物濃度的選擇 設置10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL 六個藥物濃度組及對照組。按1×105個/mL密度接種細胞于96孔板中，每孔100μL，每種濃度設4孔重復，邊緣空白孔加PBS保持濕度。于培養箱中培養12h，待細胞貼壁后按照分組加入藥物，24h后每孔加入20μLMTT，置于CO2體積分數為5%，溫度為37℃的條件下繼續培養4h，棄上清，每孔加150μl DMSO，于搖床上搖10min，酶標儀上以490nm波長測定吸光度。

2．4 最優加藥時間的確定 將細胞按1×105個/mL密度接種細胞于96孔板中，每孔100μL，共三組，分別標注為A(24h)、B(48h)和C(72h)，每組4孔重復并設置對照組。于培養箱中培養12h后選擇上述實驗優化出的最佳藥物濃度加藥，24h后取出A組每孔加入20μLMTT，置于CO2體積分數為5%，溫度為37℃的條件下繼續培養4h，棄上清，每孔加150μL DMSO，于搖床上搖10min，酶標儀上于490nm波長測定吸光度。B和C組分別于48h和72h后進行相同處理。

3 結果

3．1 最優藥物濃度為20μg/mL 24h后進行MTT檢測得到的結果如圖2。最優藥物濃度為20μg/mL，而對照組的OD值為0．905，低于20μg/mL加藥組的結果，說明這個濃度的香葉木苷對細胞的生長有促進作用。

3．2 最優加藥時間為48h 經MTT檢測后得到圖3的結果，證明48h是最優加藥時間。

圖1 不同濃度藥物對臍靜脈內皮細胞的影響

圖2 不同加藥時間對臍靜脈內皮細胞的影響

表1 不同濃度香葉木苷對臍靜脈內皮細胞的抑制率

表2 不同培養時間對臍靜脈內皮細胞的抑制

圖3 香葉木苷濃度抑制率曲線

圖4 香葉木苷培養時間抑制率曲線

計算得到的香葉木苷藥物對臍靜脈內皮細胞的抑制率如表1。從表1可看出香葉木苷對細胞的抑制作用為先降低后增高，在20μg/mL時達到最低，為負值，進一步說明此時藥物對細胞的生長有促進作用。但是隨著濃度的進一步增大，香葉木苷對細胞的抑制率逐漸增大，表現為細胞毒性作用。由此得出香葉木苷作用于臍靜脈內皮細胞的最佳藥物濃度為20μg/mL。

圖3可知，香葉木苷對細胞生長有抑制作用，抑制作用先減小再增大，在48h時抑制作用最低。經軟件分析，香葉木苷對臍靜脈內皮細胞的生長抑制率達到50%所需的用量即IC50為254.8μg/mL。

4 討論

圖1中香葉木苷濃度為20μg/mL時的OD值達到了0.911，而本組實驗的對照組即未加藥的細胞OD值才為0.905，說明此時香葉木苷對臍靜脈內皮細胞的生長起到促進作用，同時抑制率和抑制率曲線也驗證了這個結論，IC50的值也說明香葉木苷需要很大濃度時才能使細胞的死亡率達到50%。抑制率在20μg/mL時達到了負值，也就說這個時候的作用是促進而不是抑制。

圖2和圖4說明了時間對香葉木苷作用于細胞的影響，即抑制作用先降低后增大，在48h時抑制作用是最低的。時間試驗的抑制率先降低后增加，可能的原因是香葉木苷剛加入時對細胞有個適應的過程，此時表現為抑制，但隨著加入的時間延長，細胞表現出適應狀態，抑制率逐漸降低，在48h時達到最低，即達到最佳加藥濃度。

從以上結論來看，香葉木苷除在動物個體上有具有增加靜脈張力，改善靜脈通透性，改善微循環等作用，在細胞層面上合適的濃度和一定的時間范圍內對細胞的生長也有促進作用，這就為下一步研究形成靜脈血栓及香葉木苷治療靜脈血栓發揮作用的相關蛋白奠定基礎。

［1］馬英麗，盧衛紅，于曉敏，等．蓬子菜的化學成分研究［J］．中草藥，2005(10):28－30．

［2］蔣朱明，曹金鐸．口服微循環調節劑治療急性痔發作的隨機雙盲臨床研究［J］．中華普通外科雜志，2000，15(7):431．

［3］喬彤，劉長健，顧松．口服香葉木苷治療肢體水腫的臨床研究［J］．江蘇醫藥科技，2002，28(1):33．

［4］楊軍，王靜，陳禾．香葉木苷止血作用實驗研究［J］．中國藥理學通報，1996，12(6):512．

［5］Sebastián P．F．，Cristina W．，Leonardo M．L．，et al．Central nervous system depressant action of flavonoid glycosides［J］．European Journal of Pharmacology，2006，539:168 －176．

［6］Miguel A．C．，Manuel E．，Guiomar P．，Emilio G － Q．，et al．Simultaneous determination of diosmin and diosmetin in human plasma by ion trap liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry:Application to a clinical pharmacokinetic study．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis［J］．2010，51:875 －881．

［7］Andrei A．Bunaciu，Gabriela E．U．，et al．Determination of diosmin in pharmaceutical formulations using Fourier transforms infrared spectrophotometry［J］．Saudi Pharmac － eutical Journal，2009，17:303 －306．

［8］馬英麗，馬超．香葉木苷在大鼠體內的藥代動力學研究［J］．中國中藥雜志，2007，32(5):418 －420．

［9］盧衛紅．中藥蓬子菜藥效物質基礎及質量標準研究［D］．哈爾濱:黑龍江中醫藥大學，2004．

［10］朱惠蓮，夏敏，唐志紅，等．人臍靜脈內皮細胞體外培養、鑒定與形態學特征觀察［J］．中國臨床康復，2004，8(27):5834－5835．